[发明专利]一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法有效
| 申请号： | 201410523240.X | 申请日： | 2014-10-08 |
| 公开（公告）号： | CN104232804A | 公开（公告）日： | 2014-12-24 |
| 发明（设计）人： | 陈坚;堵国成;康振;张娜 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12Q3/00 | 分类号： | C12Q3/00;C12N9/42;C12R1/84 |
| 代理公司： | 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 梯度 诱导 提高 透明质酸酶 表达 方法 | ||
1.一种提高透明质酸酶表达量的方法，其特征在于，是在发酵产透明质酸酶的重组毕赤酵母的诱导产酶阶段，采用梯度变温诱导，分阶段调节培养温度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是指分阶段降低培养温度，后一阶段的培养温度低于前一阶段的温度，最后阶段的最低温度不低于20℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是在诱导开始的1-30h温度在25-30℃之间，30-60h时的温度在23-28℃之间且比1-30h时的温度低，60-108h时的温度在20-25℃之间且比30-60h温度低。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是1-66h温度在23-28℃之间，66-108h温度在20-25℃之间，且66-108h时的温度低于1-66h时的温度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母为P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his；所述重组毕赤酵母表达核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的透明质酸酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导产酶阶段是指当OD600为220-240时开始加入甲醇诱导。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤是：将重组毕赤酵母种子液接种至发酵培养基中，在温度28-32℃、pH5.0-6.5培养至OD600为220-240，开始诱导培养，在诱导开始的1-60h内为调整培养温度为25-30℃，60-108h内为20-25℃，且60-108h的温度低于1-60h内的温度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养至OD600为220-240，包括在培养至OD600为70-80时开始甘油补料，补料结束后继续培养至OD600220-240。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述诱导，是添加甲醇诱导，并控制甲醇的浓度在15-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述控制甲醇的浓度为18g/L。
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