[发明专利]一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法

说明书

技术领域

本发本发明涉及一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

温度是影响细胞生长和目的蛋白产率及稳定性的一个重要因素。温度对毕赤酵母生长的影响主要是对细胞生长速率的影响，在菌体生长阶段，生长温度通常为28～30℃，但是对于表达外源蛋白而言，温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的。Li等摇瓶实验说明，表达阶段温度降低(23℃)与细胞生长和细胞活性呈正相关。Jahic等通过分析，P.pastoris表达融合蛋白的降解，发现低温对减轻目的蛋白降解有利。而Curvers等说明低温能减少目的蛋白降解是由于减少发酵液中蛋白酶的比活引起的。Jahic等进一步说明降低诱导温度可减少细胞的死亡率，从而减少了宿主细胞蛋白酶的释放。温度还能影响AOX酶活性，降低温度可提高AOX基因转录水平3～5倍。

目前，水蛭来源的透明质酸酶基因已实现在毕赤酵母中的表达，而透明质质酸酶的表达有通过分子操作手段来实现其高效表达，其实在表达载体与表达宿主已经确定的情况下，菌株的培养条件就显得至关重要了。

本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，通过改变诱导温度，实现透明质酸酶的高效表达，进一步推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。

发明内容

本发明提供一种提高透明质酸酶表达量的方法，是在发酵产透明质酸酶的重组毕赤酵母的诱导产酶阶段，采用梯度变温诱导，分阶段调节培养温度。

所述分阶段调节培养温度，是指分阶段降低培养温度，后一阶段的培养温度低于前一阶段的温度，最后阶段的最低温度不低于20℃。

所述分阶段调节培养温度，可以是1-30h温度在25-30℃之间，30-60h温度在23-28℃之间且比1-30h时的温度低，60-108h温度在20-25℃之间且比30-60h温度低。

所述分阶段调节培养温度，还可以是1-66h温度在23-28℃之间，66-108h温度在20-25℃之间，且66-108h时的温度低于1-66h时的温度。

所述分阶段调节培养温度，在本发明的一种实施方式中是1-60h为25℃，60-108h为22℃。

所述重组毕赤酵母菌株是表达透明质酸酶的重组菌。

所述透明质酸酶在本发明的一种实施方式中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述重组毕赤酵母在本发明的一种实施方式中是以GS115为出发菌株，表达SEQ ID NO.1所示基因序列的透明质酸酶，且在基因上添加了组氨酸标签和核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的信号肽的重组P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his。

所述诱导产酶是采用毕赤酵母表达外源基因时的常规诱导表达方式进行。

所述诱导产酶在本发明的一种实施方式中是在菌株生长的对数期进行诱导。

所述发酵，在本发明的一种实施方式中是将种子液接种至发酵培养基中，在温度28-32℃、pH5.0-6.5培养至OD₆₀₀220-240，开始诱导产酶，在诱导开始的1-60h范围内为调整培养温度为23-28℃，60-108h范围内调整为20-25℃。

所述种子液的接种量为1-20％

所述发酵培养基为以下任意一种：BSM培养基、BMGY培养基、BMMY培养基。

所述发酵培养基的装液容器可以是发酵罐或者摇瓶。

所述培养基体积与装液容器的体积比为10％-60％。

所述培养至OD₆₀₀220-240，包括在OD₆₀₀为70-80时开始补料培养，补料结束后继续培养至OD₆₀₀220-240。

所述补料培养的具体方法是：向发酵液中补加甘油，补料体积(mL)如下表：

所述补料培养的甘油中，还可以添加微量金属溶液PTM1，使甘油中PTM1浓度为8-20mL/L。

所述补料培养，甘油添加方式在本发明的一种实施方式中是指数流加方式。

所述开始诱导培养，是通过添加甲醇，控制甲醇的浓度在15-20g/L。

所述控制甲醇的浓度，在本发明的一种实施方式是18g/L。

所述添加的甲醇中，还可以添加有PTM1，使甲醇中PTM1的浓度为流加含有8-12mL/L。