[发明专利]一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用

摘要

本发明公开了一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，再构建pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后应用Cre/LoxP特异性结合位点重组系统切除筛选标签，重新获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，可再次被用于遗传改造。本发明所提供的方法可构建高效的土曲霉基因打靶平台，具有同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等优点，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。

主权项

1.一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后以直接向原生质体细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除两侧带有同向loxP序列的pyrG筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能再次用于基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化；步骤如下：1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At‑Δku80；2)构建pyrG基因的打靶元件pyrG‑KO，敲除步骤1)所得重组菌At‑Δku80的pyrG基因，获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At‑Δku80‑ΔpyrG；3)以两端带有同向loxP序列的曲霉pyrG基因表达元件pyrG1为筛选标签构建以ku80基因上下游序列作为同源臂的打靶元件ku80‑pyrG1‑gfp，将打靶元件ku80‑pyrG1‑gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At‑Δku80‑ΔpyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及验证后，建立基于尿嘧啶营养缺陷型重组菌At‑Δku80‑ΔpyrG和pyrG1的遗传转化系统，获得整合有loxP‑pyrG1‑loxP筛选标记的的重组菌At‑Δku80‑pyrG1‑loxP；4)制备步骤3)所得重组菌At‑Δku80‑pyrG1‑loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向所得的原生质体内导入Cre重组酶切除两侧带有同向loxP序列的筛选标签pyrG1，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrG1筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At‑Δku80‑ΔpyrG1‑loxP；所述辅助载体为筛选标签pyrG1的双链DNA；具体步骤如下：1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO.2‑SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80上游序列U‑ku80；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.7所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80下游序列D‑ku80；通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U‑ku80和下游序列D‑ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO.8‑SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80‑A，再以如SEQ ID NO.10‑SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80‑B；再将打靶元件ku80‑A和打靶元件ku80‑B同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At‑Δku80；2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.12‑SEQ ID NO.13所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U‑pyrG；再以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.14‑SEQ ID NO.15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列D‑pyrG；再利用融合PCR融合上游序列U‑pyrG和下游序列D‑pyrG，以融合产物的序列为模板，以如SEQ ID NO.16‑SEQ ID NO.17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因的打靶元件pyrG‑KO，再制备步骤1)所得重组菌At‑Δku80的原生质体，再将pyrG基因的打靶元件pyrG‑KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株At‑Δku80‑ΔpyrG；3)通过人工合成带有两个同向loxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA片段克隆在载体pUC57simple上，获得载体PalcA‑syn；以黑曲霉Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO.18‑SEQ ID NO.19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrG1，再将筛选标签pyrG1克隆到载体PalcA‑syn上，获得质粒pXH103，获得如SEQ ID NO.26所示的两侧带有同向loxP位点序列的pyrG1筛选标签loxP‑pyrG‑loxP；再以pSGF957为模板，以如SEQ ID NO.20‑SEQ ID NO.21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp‑TtrpC，再将gfp‑TtrpC片段连接到质粒pXH103上，获得质粒pXH104；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.22‑SEQ ID NO.23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.24‑SEQ ID NO.25所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质粒pXH105上，获得质粒pXH106；最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80‑pyrG1‑gfp；再将打靶元件ku80‑pyrG1‑gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At‑Δku80‑ΔpyrG中，经过培养筛选后获得带有loxP‑pyrG1‑loxP的重组菌At‑Δku80‑pyrG1‑loxP；从而证明成功建立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统；4)制备步骤3)所得重组菌At‑Δku80‑pyrG1‑loxP的原生质体，向已制备好的100μL浓度为108个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1μgpyrG1片段和10μL40％的PEG4000，混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30℃下孵育30min，孵育结束后与含有1.2M山梨醇、4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有1.2M山梨醇，1g/L 5‑氟乳清酸和10mM尿嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板中，在30℃、黑暗条件下培养6‑10天，培养结束后挑取转化子接种到CDFU平板上于32℃下培养5‑7天进行传代纯化，传代纯化3‑5次后，再挑取转化子接种到CD平板上，在32℃下培养5‑7天后获得同源重组能力提高，且不受筛选标签数量限制的用于基因打靶的土曲霉重组菌At‑Δku80‑ΔpyrG1‑loxP；所述pyrG1片段为黑曲霉的pyrG基因的表达元件。