[发明专利]一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用

权利要求书

1.一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后以直接向原生质体细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除两侧带有同向loxP序列的pyrG筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能再次用于基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化；步骤如下：

1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At-Δku80；

2)构建pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，敲除步骤1)所得重组菌At-Δku80的pyrG基因，获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG；

3)以两端带有同向loxP序列的曲霉pyrG基因表达元件pyrG1为筛选标签构建以ku80基因上下游序列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrG1-gfp，将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及验证后，建立基于尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG和pyrG1的遗传转化系统，获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标记的的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；

4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向所得的原生质体内导入Cre重组酶切除两侧带有同向loxP序列的筛选标签pyrG1，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrG1筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP；所述辅助载体为筛选标签pyrG1的双链DNA；具体步骤如下：

1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80上游序列U-ku80；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80下游序列D-ku80；通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B；再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Δku80；

2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG；再以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列D-pyrG；再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为模板，以如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，再制备步骤1)所得重组菌At-Δku80的原生质体，再将pyrG基因的打靶元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG；

3)通过人工合成带有两个同向loxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA片段克隆在载体pUC57simple上，获得载体PalcA-syn；以黑曲霉Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrG1，再将筛选标签pyrG1克隆到载体PalcA-syn上，获得质粒pXH103，获得如SEQ ID NO.26所示的两侧带有同向loxP位点序列的pyrG1筛选标签loxP-pyrG-loxP；再以pSGF957为模板，以如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC，再将gfp-TtrpC片段连接到质粒pXH103上，获得质粒pXH104；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.25所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质粒pXH105上，获得质粒pXH106；最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrG1-gfp；再将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中，经过培养筛选后获得带有loxP-pyrG1-loxP的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；从而证明成功建立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统；

4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，向已制备好的100μL浓度为10⁸个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1μgpyrG1片段和10μL40％的PEG4000，混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30℃下孵育30min，孵育结束后与含有1.2M山梨醇、4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有1.2M山梨醇，1g/L 5-氟乳清酸和10mM尿嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板中，在30℃、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到CDFU平板上于32℃下培养5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，再挑取转化子接种到CD平板上，在32℃下培养5-7天后获得同源重组能力提高，且不受筛选标签数量限制的用于基因打靶的土曲霉重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP；所述pyrG1片段为黑曲霉的pyrG基因的表达元件。