[发明专利]一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用

说明书

本发明公开了一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，再构建pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后应用Cre/LoxP特异性结合位点重组系统切除筛选标签，重新获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，可再次被用于遗传改造。本发明所提供的方法可构建高效的土曲霉基因打靶平台，具有同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等优点，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。

技术领域

本发明涉及一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产，具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目标产物的生产水平，具有非常重要的意义。

基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增加外源 DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组学以及菌株的基因工程改造研究中发挥着至关重要的作用。随着大量组学数据的不断公布，功能基因组学研究以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点，而且还会用到多种研究策略。因此一种高效的遗传操作平台将可以为土曲霉功能基因组学研究以及菌株基因工程改造提供很大的便利。

在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologousEnd Joining，NHEJ)，从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效率低下，使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。

筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件，外源DNA需要与筛选标签一起整合到基因组上，然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标签非常少，无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重要的分子遗传操作工具，在多种原核生物和真核生物中都成功应用于筛选标签的切除。其原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上，催化重组反应，使得位于靶位点之间的 DNA片段被剔除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β-rec/six系统和Flp/FRT系统，但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中导入重组酶表达元件，通过在细胞内表达出重组酶作用于识别位点对筛选标签进行切除。pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因)是一种与尿嘧啶营养缺陷型菌株搭配使用的营养选择型标签，基于pryG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征，筛选标签存在与否都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用，会使得筛选标签的剔除更加高效、易行。

发明内容

为解决土曲霉菌种的同源重组能力低，筛选标签数量少导致基因打靶技术在土曲霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA的同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后以直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除两侧带有同向 loxP序列的筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能再次用于基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化，以该方式实现筛选标签的循环利用。