[发明专利]一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，特点是具体步骤如下：从盐生杜氏藻中克隆出玉米黄质合成的关键限速酶基因—β-胡萝卜素羟化酶基因，并将基因构建到穿梭表达载体pRL25C中，通过三亲接合方法转到鱼腥藻中，通过抗性筛选得到转基因的鱼腥藻，并经过16000Lx强光处理后，优点是实现转基因鱼腥藻的玉米黄质的含量较野生型藻有较大幅度的提高，最大可提高3.8倍。

主权项

1.一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript®RTMasterMix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；（2）盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得根据盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（登录号:JN118489）开放阅读框，设计上游引物chyb-orf-F：CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG和下游引物chyb-orf–R：CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR反应体系为：ddH₂O9.5μl，PremixExTaq^TMHotStartVersion12.5μl，chyb-orf–F1μl，chyb-orf-R1μl，盐生杜氏藻cDNA1μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得chyb目的基因条带，纯化回收连接到pMD-19T克隆载体中，转化E.coliDH5a感受态细胞中，得到重组质粒pMD-19T-chyb；（3）穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建将重组质粒pMD-19T-chyb和穿梭表达载体pRL-25C同时进行BamHI和EcoRI双酶切，回收大、小目的片段，连接回收的目的基因片段和线性载体片段，16℃连接过夜，转化挑选阳性克隆，得到穿梭表达载体pRL-25C-chyb；（4）供体菌的获得将接合转移质粒pRL-443，辅助质粒pRL-623，pRL-25C-chyb质粒转化到感受态细胞HB101中，采用含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基筛选，挑选单菌落，得到供体菌；（5）三亲接合取一定体积对数期鱼腥藻，4000rpm室温离心5min，用新鲜的BG11液体培养基洗涤重悬两次，使其OD₆₆₅达到0.3（1个OD浓度约4.5×10⁷cells/mL）,取一定体积的供体菌，4000rpm室温离心5min后用LB液体培养基洗涤重悬两次，调整浓度使其与鱼腥藻细胞浓度一致，将同浓度鱼腥藻与供体菌按3:1体积混匀后，光照培养24h；（6）转基因鱼腥藻筛选将混有供体菌的鱼腥藻涂至硝酸纤维素酯膜上，再将硝酸纤维素酯膜置于无抗BG11固体培养基，倒置光照培养3d，再逐步将硝酸纤维素酯膜分别移至含7.5μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含15μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含20μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基和含30μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基上培养，挑选单藻落，移至含30μg/mL卡那抗生素的BG11液体培养基中培养，逐级扩大培养，获得转基因鱼腥藻；（7）转基因鱼腥藻检测提取转基因鱼腥藻DNA作为模板，采用chyb-RT-F：CCGCCTCGTCTCAGGAATG；chyb-RT-R:ACCGAGCCCACATCTCCATT作为引物，以野生鱼腥鱼腥藻DNA和质粒pRL-25C-chyb分别作为空白对照和阳性对照，进行PCR扩增；（8）转基因鱼腥藻强光处理将步骤（7）中PCR扩增成功的转基因鱼腥藻在普通光照下培养3天使盐藻处于对数生长期，然后在黑暗条件下饥饿培养16h后，置于强光16000Lx下培养7天，即获得高玉米黄质含量的鱼腥藻。