[发明专利]一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法

权利要求书

1.一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript?RT Master Mix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；

（2）盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得

根据盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（登录号: JN118489）开放阅读框，设计上游引物chyb-orf-F：CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG和下游引物chyb-orf–R： CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR反应体系为：dd H₂O 9.5 μl，Premix Ex Taq^TMHot Start Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，盐生杜氏藻cDNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得chyb目的基因条带，纯化回收连接到pMD-19T 克隆载体中，转化E.coli DH5a感受态细胞中，得到重组质粒pMD-19T-chyb；

（3）穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建

将重组质粒pMD-19T-chyb 和穿梭表达载体pRL-25C同时进行BamH I和EcoR I双酶切，回收大、小目的片段，连接回收的目的基因片段和线性载体片段，16℃连接过夜，转化挑选阳性克隆，得到穿梭表达载体pRL-25C-chyb；

（4）供体菌的获得

将接合转移质粒pRL-443，辅助质粒pRL-623，pRL-25C-chyb质粒转化到感受态细胞HB101中，采用含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基筛选，挑选单菌落，得到供体菌；

（5）三亲接合

取一定体积对数期鱼腥藻，4000 rpm室温离心5 min，用新鲜的BG11液体培养基洗涤重悬两次，使其OD₆₆₅达到0.3（1个OD浓度约4.5 ×10⁷cells/mL）, 取一定体积的供体菌，4000 rpm室温离心5 min后用LB液体培养基洗涤重悬两次，调整浓度使其与鱼腥藻细胞浓度一致，将同浓度鱼腥藻与供体菌按3:1体积混匀后，光照培养24h；

（6）转基因鱼腥藻筛选

将混有供体菌的鱼腥藻涂至硝酸纤维素酯膜上，再将硝酸纤维素酯膜置于无抗BG11固体培养基，倒置光照培养3d， 再逐步将硝酸纤维素酯膜分别移至含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含15 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含20 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基和含30 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基上培养，挑选单藻落，移至含30 μg/mL卡那抗生素的BG11液体培养基中培养，逐级扩大培养，获得转基因鱼腥藻；

（7）转基因鱼腥藻检测

提取转基因鱼腥藻DNA作为模板，采用chyb-RT-F：CCGCCTCGTCTCAGGAATG；chyb-RT-R: ACCGAGCCCACATCTCCATT作为引物，以野生鱼腥鱼腥藻DNA和质粒pRL-25C-chyb分别作为空白对照和阳性对照，进行PCR扩增；

（8）转基因鱼腥藻强光处理

将步骤（7）中PCR扩增成功的转基因鱼腥藻在普通光照下培养3天使盐藻处于对数生长期，然后在黑暗条件下饥饿培养16 h后，置于强光16000 Lx 下培养7天，即获得高玉米黄质含量的鱼腥藻。