[发明专利]一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种通过在鱼腥藻中表达盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因以提高玉米黄质含量的方法。 

背景技术

玉米黄质（3，3'-二羟基-β-胡萝卜素）作为一种天然萜烯类不饱和类胡萝卜素，可通过Wittig方法化学合成。但化学合成的玉米黄质不仅难被人体吸收，甚至对人体有害，目前只有从天然植物或藻类提取的玉米黄质才具有抗氧化等生物活性。天然玉米黄质主要存在于蔬菜（菠菜、羽衣甘蓝、玉米、辣椒等）、花卉（金盏花、万寿菊花等）和水果（枸杞、甜橙）中，禽蛋的蛋黄中也存在玉米黄质（鸡蛋、鹌鹑蛋），但含量较低。玉米黄质和其他的类胡萝卜素一样，存在共轭双键结构，使得玉米黄质具备强抗氧化功效，可以阻断自由基链式传递。玉米黄质可防止脂质过氧化，而细胞脂质的过氧化与肿瘤的发生具有一定关系，因此玉米黄质具有清除自由基的能力，可有效预防癌症，科研人员对100名大肠癌和肺癌的患者血液进行检查，患者血液中的玉米黄质含量比健康者低大约20%。此外玉米黄质作为重要的营养素，抑制心血脑血管的脂质过氧化以达到预防心血管疾病和中风。玉米黄质在保护眼睛视力方面也有着不可替代的作用。氧化、光损伤是造成老年性黄斑变性和白内障的主要原因。据估计有超过1700万美国人有AMD症状，超过200万人遭遇功能性失明，而在中国也有数以万计的人遭遇白内障痛苦。玉米黄质在保护视力方面具有独特的生理功能。一些临床研究发现在饮食中提高膳食纤维或血清中玉米黄质和叶黄素的含量，可有效降低老年性黄斑变性和老年性白内障患病风险。 

植物中合成类胡萝卜素途径表明，玉米黄质是通过一系列酶作用合成，其中β-胡萝卜素羟化酶（chyb）是玉米黄质合成过程中一个关键限速酶，它能以β-胡萝卜素为底物催化形成 β-隐黄素，β-隐黄素可进一步生成双羟基终产物玉米黄质。该酶是一种非血红素双铁加氧酶，它可能是通过获得光合电子传递链中铁氧还蛋白的电子，在含铁的酶活性中心利用活化的分子氧去打断β-胡萝卜素羟化酶C3（C3'）处的C-H键并形成羟基。植物能合成玉米黄质外，许多海洋微藻能在特定的条件下具有合成玉米黄质的能力，如蓝藻中的集胞藻6803、北冰洋聚球藻；绿藻中的盐生杜氏藻等，但是蓝藻中的鱼腥藻中玉米黄质的含量非常低。 

鱼腥藻7120作为模式藻类，自身含有多种氨基酸、藻蓝蛋白及类胡萝卜素，可以作为微藻饲料，并能高效固氮而提供生物氮源。鱼腥藻7120于2001年继集胞藻6803完成全基因组测序，已经成为很多实验室研究工作中对象。随着三亲接合转化体系的完善，鱼腥藻7120目前已经成功表达了多种外源基因，成为蓝藻中可进行外源基因转移模式藻。转基因蓝藻在生物工程上具有广阔的应用前景，如药物重组，生产具有生物活性物质（抗肿瘤药物、疫苗），进行污水处理等等，对环境保护和医药研发方面产生不可估量的效益。盐生杜氏藻的显著特性是其在逆境胁迫下可合成比其他生物高很多的β-胡萝卜素来抵御不利环境，同时盐生杜氏藻中还有另一种类胡萝卜素——玉米黄质，因此，盐生杜氏藻chyb基因序列对提高其他植物中玉米黄质的含量具有很大的潜在价值。但是，盐生杜氏藻不易进行外源基因转移，且会出现整合不易、表达不稳、基因沉默等缺点，不利于采用代谢工程策略提高次生代谢产物含量或生产药用物质。 

目前国内外还没有公开任何关于通过在鱼腥藻中表达盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因以提高玉米黄质含量的方法的相关研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能使鱼腥藻在强光下大量积累玉米黄质的提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，具体包括以下步骤： 

（1）提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript?RT Master Mix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；

（2）盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得