[发明专利]一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺

说明书

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，包括以下步骤：S1：配制含第一诱导剂和第二诱导剂的TB培养基；所述第一诱导剂为卵磷脂；所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:(0.1‑0.3)的质量比混合而成；S2：将大肠杆菌生产种子接种至LB培养基，36‑38℃摇床震荡过夜培养；S3：将S2所得一级种子接种至含有TB培养基的发酵罐内，36‑38℃发酵培养12‑18h；S4：当发酵罐内发酵体系的光密度OD值达到3‑5时，调整诱导温度设置为15‑20℃，低温诱导20‑28h。本发明发酵工艺无需采用IPTG诱导表达，发酵体系易于控制，目标蛋白收率高，安全无害。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺。

背景技术

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的功能性结构蛋白，广泛存在于机体内的皮肤、肌腱、血管、牙齿、骨骼等结缔组织的细胞外基质中，在伤口愈合、细胞修复、皮肤抗衰老、细胞免疫等方面具有重要的应用价值。胶原蛋白由 3 条α 链的多肽链亚基组成，α 链自身构型为左手螺旋，三条 α 链又互相缠绕成右手螺旋结构，即胶原蛋白的“胶原域” ，其肽链通式为(Gly-X-Y)n，其中 X一般为Pro（脯氨酸），Y一般为Hyp（羟脯氨酸）。目前，胶原蛋白主要分为 I 型、II 型、III 型等类型，I 型胶原蛋白分子组成为[α1(I)]₂α2(I)，主要分布于骨骼中；II 型胶原蛋白由[α1(II)]₃ 组成，主要由软骨细胞产生；III型胶原蛋白分子组成为[α1(III)]₃，由于半胱氨酸的存在，肽链间能形成二硫键，可构成细纤维，主要存在于表皮层和真皮层之间的微胶原层，是维持肌肤高弹饱满的关键。

重组人源胶原蛋白是基于人体皮肤Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的原始基因序列，并一步优化选择其中高水溶性、高生物活性的部分，进行密码子优化和拼接重组，得到了全新的重组人源Ⅲ型胶原蛋白序列，并导入大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母等微生物体内，利用微生物发酵技术进行规模化生产。但是，目前利用微生物发酵重组人源胶原蛋白一般需要利用IPTG诱导，作为乳糖类似物，应用于Lac乳糖操纵子的表达系统，但IPTG对于人体存在潜在的不可逆毒性，摄入或皮肤吸收后，造成细胞损伤，又由于IPTG稳定性高不被菌体代谢，利用其诱导时，能在人体内不断富集，存在生物安全性问题。此外，利用IPTG诱导的浓度不易控制，由于IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合以启动目的蛋白的转录，浓度较低时，无法诱导目的蛋白完全表达，产量低；浓度较高时，会导致包涵体的形成。因此，如何提供一种非IPTG诱导的高表达水平的重组人源化胶原蛋白发酵方法是亟待解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，以解决传统发酵工艺需要采用IPTG诱导表达的技术问题。

基于上述目的，本发明提供了一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，包括以下步骤：

S1：配制TB培养基：胰蛋白胨20-30g/L、酵母提取物40-60g/L、K₂HPO₄ 70-75 mM、KH₂PO₄ 15-20 mM、第一诱导剂0.8-1.2mM、第二诱导剂0.05-0.1g/L、蛋白保护剂0.5-1g/L、甘油3-5g/L、余量为水；

所述第一诱导剂为卵磷脂；

在重组人源化胶原蛋白的发酵生产中，卵磷脂可作为其表达的外源诱导剂，卵磷脂能够在大肠杆菌细胞膜上形成微区域，提高细胞膜的流动性以及扩散作用，同时，卵磷脂能结合目标蛋白的信号肽，促进胶原蛋白转运到膜外，进而提高重组人源化胶原蛋白的表达和分泌，提高其收获量；

所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:(0.1-0.3)的质量比混合而成；