[发明专利]一种提高绿针假单胞菌中吩嗪-1-羧酸产量方法

说明书

本发明属于生物工程领域，提供了一种提高绿针假单胞菌中吩嗪‑1‑羧酸产量方法。以具有吩嗪1‑羧酸合成能力的绿针假单胞菌Qlu‑1为出发菌株，我们首先在敲除了修饰基因phzO获得菌株QPCA，使菌株中催化PCA转化成2‑羟基吩嗪的PhzO酶失活，菌株专一性积累PCA，之后在菌株QPCA基础上，先后在其基因组上敲除具有负调控作用的AraG、CheB等基因，构建PCA生产菌株QPCAΔA,QPCAΔC,QPCAΔAΔC，PCA的产量由270.4mg/L提升到3053.9mg/L，为PCA的大规模生产奠定重要基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种通过生物工程手段提高绿针假单胞菌中生物活性物质吩嗪-1-羧酸产量的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

使用农药一直以来都是农业增产增收的重要手段，然而目前市面上的农药大部分是经过条件苛刻的化学合成来生产的化学农药。化学农药在农作物保产增产上不可忽视，然而其生产过程往往会产生有毒有害物质，实用到农田里的农药也往往不易降解，造成严重的农药残留，造成生态环境污染。因此寻找化学农药的替代品成为目前科技工作者的重要研究内容。生物农药是一类由微生物等生物天然合成的生物活性物质，不仅对农作物的病虫害有着良好的防治效果，而且往往具备易被生物降解等特点。因此生物农药成为化学农药很好的替代品。

吩嗪-1羧酸(PCA)是一种生物活性物质，因为其对农作物病虫害的良好效果，2011年被中华人民共和国农业农村部授予农药证书，并正式命名为“申嗪霉素”，目前吩嗪-1-羧酸的生产已经由化学生产变为以铜绿假单胞菌发酵生产。然而铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌，长远来看并不太适合作为生产菌株来推广应用，相比于铜绿假单胞菌，绿针假单胞菌同样含有吩嗪类物质合成的核心基因部件-phzABCDEFG，但并不是条件致病菌，可以作为生产PCA的替代菌株。

发明人之前的研究：获得了一株绿针假单胞菌Qlu-1，其是一株筛选自山东省潍坊市蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌，经测序得知含有吩嗪类物质合成所需的核心基因簇-phzABCDEFG，以及修饰基因phzO，可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪，前期还研究表明，PhzO酶可以催化吩嗪-1-羧酸转化为2-羟基吩嗪，因此敲除phzO基因可以使菌株只积累生产吩嗪-1-羧酸。因此，发明人前期工作中敲除了菌株Qlu-1中的phzO基因，经发酵得知，PCA的最高产量在270mg/L左右，远远达不到推广应用的水平。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种提高绿针假单胞菌中吩嗪-1-羧酸产量方法。通过基因工程的方法提升了工程菌株产量，为推广应用做准备。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种提高绿针假单胞菌中吩嗪-1-羧酸产量方法，包括：

以绿针假单胞菌Qlu-1为出发菌株，敲除修饰基因phzO，获得菌株QPCA；

以所述菌株QPCA为出发菌株敲除AraG基因和/或CheB基因，获得菌株QPCAΔA、QPCAΔC、QPCAΔAΔC中至少一种；

以所述菌株QPCAΔA、QPCAΔC、QPCAΔAΔC中至少一种发酵生产吩嗪-1-羧酸，即得。

本发明的第二个方面，提供了一种用于提高绿针假单胞菌中吩嗪-1-羧酸产量的工程菌，以绿针假单胞菌Qlu-1为出发菌株，敲除修饰基因phzO，获得菌株QPCA；

以所述菌株QPCA为出发菌株敲除AraG基因和/或CheB基因，获得菌株QPCAΔA、QPCAΔC、QPCAΔAΔC中至少一种。

本发明的第三个方面，提供了一种菌剂，包括：至少一种上述的工程菌。