[发明专利]一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，属于细胞工程领域。该方法包括如下步骤：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；加入25‑100ng/ml IFN‑γ和25‑100ng/mlLPS,激活极化巨噬细胞6‑48h；激活极化后，按照100‑1000 MOI加入腺病毒，转染12‑24h，转染目的基因。采用本发明的方法，转染效率高达90%以上，提高了巨噬细胞基因导入的成功率，而且，该方法操作简单，大大节约成本。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体地说，涉及一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法。

背景技术

嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）疗法已经成为细胞免疫治疗领域的一个重要的方向。该疗法是将从外周血来源的CD14阳性单核细胞诱导成巨噬细胞，并通过病毒的形式将外源基因导入巨噬细胞，生产CAR-Mac。

目前，通过病毒转染方式生产嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）主要有两种方式：慢病毒和腺病毒，这两种方式虽然都有一定的转染效率，但是由于巨噬细胞的特性，转染效率在20%以下。有部分研究人员通过改造腺病毒（Ad5F35腺病毒）感染巨噬细胞，虽然提高了腺病毒转染巨噬细胞的效率，转染效率约为提50%左右，但是该种方法需要使用大量腺病毒，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Mac）成本较高。虽然有其他研究人员也试图通过改造慢病毒，使用LV-Vpx慢病毒转染巨噬细胞，但是转染效率依然不高，而且，慢病毒转染有随机整合的风险，存在造成巨噬细胞基因突变的风险。

综上可知，现有技术中，腺病毒转染巨噬细胞的方法，存在转染效率低，浪费材料，成本高的缺点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，该方法适用于腺病毒转染外周血来源的巨噬细胞，转染效率高达90％以上，同时，该转染方法易操作，成本低。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：

S1、巨噬细胞培养：将PBMC复苏后通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25-100ng/ml GM-CSF促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO₂培养箱，培养24-72h；

S2、巨噬细胞激活和极化：更换步骤S1中的巨噬细胞的培养基，向新培养基中添加25-100ng/ml IFN-γ和25-100ng/ml LPS,激活极化巨噬细胞6-48h；

S3、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100-1000 MOI加入腺病毒，转染24-172h，转染目的基因。

S4、转染后基因表达检测：将腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200-500g 离心2-10min，收集细胞，用流式检测目的基因的表达（CAR:嵌合抗原受体）。

进一步的技术方案，所述步骤S1中，细胞接种密度为0.5×10⁶～4×10⁶个/mL；所述CO₂培养箱的温度为35～38℃,CO₂浓度为3～7％。

进一步的技术方案，所述的IFN-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；LPS的浓度为40-60ng/ml，优选50ng/ml。

进一步的技术方案，所述步骤S2中，激活活化后的巨噬细胞为M1型巨噬细胞。

进一步的技术方案，所述的腺病毒为Ad5F35腺病毒。

进一步的技术方案，所述的步骤2中，转染目的基因后，可以换液，继续培养细胞一段时间。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：