[发明专利]一种溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备

说明书

本发明公开了一种溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明构建了四个有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。其中，对DMSO和甲醇耐受性最好的突变体为G539I/R146F/D147N，较WT分别提高了1.6和1.7倍；对乙醇耐受性最好的突变体为R146F，较WT提高了1.4倍；对丙酮耐受性最好的突变体为G539I/R146F，较WT提高了1.5倍。本发明有助于拓展糖基转移酶在有机反应体系中的应用，提高CGTase对天然疏水底物的酶促效率，具有极大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备，属于酶工程和基因工程技术领域。

背景技术

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase，EC2.4.1.19)，属于α-淀粉酶家族，因其具有多种转糖基活力(环化、歧化、耦合活力)，极具商业价值，目前该酶在工业上主要用于生产环糊精，此外，该酶还含有部分水解活力，在短链糖基化反应过程中起到重要作用。近年来利用其转糖基活力改善天然底物的性质研究取得了较好的进展，如甜菊苷、芦丁、染料木素等。糖基化处理有效解决了这些物质在实际应用中溶解性差、不易储存、不稳定等多种问题，且糖基化产物多数保持了物质本身的优良性质和价值，因而在食品、化工等多个领域均有较好的应用。

然而，在应用过程中，新的问题也随之出现亟待解决。在实际应用中，直接依靠挖掘的天然环糊精糖基转移酶往往很难满足生产要求。究其原因，天然酶多数都存在酶活低，不稳定，底物混杂性差等问题，且由于环糊精糖基转移酶复杂的催化机理，常产生多种产物，产物特异性差，因此，目前对于该酶的分子改造多集中于催化活性，热稳定性，专一性等方面，并取得了不错的进展。然而，对于酶学反应，其催化效率除酶本身外，与酶所处环境也有很大的关系。在工业生产中，有机溶剂的使用是极为重要的一环，很多疏水底物的生物转化都依赖于有机溶剂，但有机溶剂往往对多数酶存在不利影响，使酶活性降低甚至失活，严重限制了生产效率。

与多数酶类似，天然的环糊精糖基转移酶在有机溶剂环境中的酶活及酶稳都会受到极大影响，因此，为了突破这一瓶颈，通过分子改造策略提高环糊精糖基转移酶的有机溶剂耐受性及其在有机溶剂中的酶活具有极大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种对溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，有利于扩大环糊精糖基转移酶对天然疏水性底物的糖基化应用。

所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第146位、第147位、第539位的氨基酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第146位的精氨酸突变为苯丙氨酸，命名为R146F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第539位的甘氨酸突变为异亮氨酸，命名为G539I。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第539位的甘氨酸突变为异亮氨酸，同时将第146位的精氨酸突变为苯丙氨酸，命名为G539I/R146F。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第539位的甘氨酸突变为异亮氨酸；同时将第146位的精氨酸突变为苯丙氨酸；同时将第147位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；命名为G539I/R146F/D147N。