[发明专利]一种提高重组贻贝蛋白黏附力的方法

说明书

本发明公开了一种提高重组贻贝蛋白黏附力的方法，该方法通过生物信息学和分子动力学模拟，计算蛋白质分子氨基酸残基的溶剂可及性，对残基位点进行定点突变。本发明中分别将野生型厚壳贻贝3型蛋白Mcofp‑3A的N33、N46、N62位点、野生型地中海贻贝3A型蛋白Mgfp‑3A的G41、N44位点和野生型地中海贻贝3B型蛋白Mgfp‑3B的G33、N43、N76位点的氨基酸突变成对贻贝蛋白起黏附作用的酪氨酸后，突变蛋白的表达无明显变化，具有SEQ ID NO.1～8中的任意一项所示的氨基酸序列，其黏附性能均有所提升，在水溶液、盐溶液中搭接18h后分别较本体蛋白的黏附力提高16‑38％、12‑82％。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基于理性设计的提高重组贻贝蛋白黏附力的方法。

背景技术

海洋贻贝，如地中海贻贝(Mytilus galloprovincalis)、厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)、紫贻贝(Mytilus edulis)等，通过其足丝分泌的贻贝蛋白(Mussel footproteins,Mfps)将自身固定在海水下的岩石、船体等表面上。这种在潮湿环境下的较强粘性、持久性、防水性和韧性，与经多酚氧化酶催化而成的酪氨酸衍生物多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine,DOPA)的含量有关。一般来说，更高DOPA含量意味着Mfps的黏附性能更加优异。在已发现的6种贻贝粘蛋白中，3型贻贝蛋白Mfp-3主要存在于足丝盘与外界直接接触的部分，是分子量较小但含有高比例DOPA的贻贝蛋白，总含量高达25％，因此其在足丝盘对外界表面进行黏附过程中起着非常重要的作用。在我国，贻贝具有非常重要的经济价值，主要分布于黄海、东海、渤海等地。

直接从贻贝足部提取的Mfps水溶性较差、含量极低、提取成本很高，且纯化过程困难。近年来，研究学者多使用基因工程技术进行贻贝蛋白的重组表达。虽然在原核表达系统及真核表达系统中均有所尝试，但重组后的蛋白的黏附性能远远不及天然贻贝，限制了其深入研究和实际应用。

基于“理性设计”的定向进化技术，即研究者根据一定的实验目的，如提高蛋白质的耐热性、耐酸性等，有目的地改造蛋白质分子的编码序列，使其符合要求。然而此项技术的难点在于，如何找出有效的改造点以及如何改造。

对蛋白质的改造，必须明确的了解有待进化的蛋白质分子的结构与功能的关系。蛋白质的结构，可以通过X-ray、NMR、冷冻电镜等方法进行解析。这些实验方法所需大型设备的金额有些高达数千万，而且方法上的局限，也会导致蛋白质结构解析困难重重。尤其是对小分子量蛋白质的解析上，难度极大。理论上，蛋白质的氨基酸序列应该可以完全决定其结构。随着人工智能的发展，通过对蛋白质三维结构的建模可以尽可能精准地获得蛋白结构。目前主流的蛋白质建模方法主要包括同源建模、折叠识别和从头计算三种方式。从头计算的方法是基于热力学基础的。蛋白质的天然构象对应其能量最低的构象。因此通过构造合适的能量函数及优化方法，便可以实现从蛋白质序列直接预测其三维结构的目的。

在测定蛋白质的三维结构后，分子模拟技术可以将其与蛋白质的功能结合起来。分子动力学模拟(molecular dynamics simulation,MD)是根据经典力学的一种计算方法，研究体系内所有粒子随时间变化的运动状态，并在一定统计力学系综下，通过在空间内取系综平均，以获取体系的物理化学相关性质。MD模拟主要从量子力学、计算化学、分子学等学科出发，根据分子力场对分子性质进行计算，从分子水平上揭示分子与分子间相互作用。MD模拟方法可以给出蛋白质、核酸等生物大分子内部运动随时间的最详实的变化情况，从而分析体系的诸多运动性质。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明要解决的技术问题是提供一种粘附性能提高的贻贝蛋白突变体。

本发明还要解决的技术问题是提供与上述贻贝蛋白突变体相关的生物材料。

本发明进一步要解决的技术问题是提供一种重组贻贝蛋白。