[发明专利]一种提高重组贻贝蛋白黏附力的方法

权利要求书

1.贻贝蛋白突变体，其特征在于，所述突变体具有SEQ ID NO.1～8中的任意一项所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述贻贝蛋白突变体，其特征在于，将野生型厚壳贻贝3型蛋白的氨基酸序列中第33位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的贻贝蛋白突变体N33Y；

将野生型厚壳贻贝3型蛋白的氨基酸序列中第46位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的贻贝蛋白突变体N46Y；

将野生型厚壳贻贝3型蛋白的氨基酸序列中第62位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的贻贝蛋白突变体N62Y；

将野生型地中海贻贝3A型蛋白的氨基酸序列中第41位的甘氨酸突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的贻贝蛋白突变体G41Y；

将野生型地中海贻贝3A型蛋白的氨基酸序列中第44位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的贻贝蛋白突变体N44Y；

将野生型地中海贻贝3B型蛋白的氨基酸序列中第33位的甘氨酸突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的贻贝蛋白突变体G33Y；

将野生型地中海贻贝3B型蛋白的氨基酸序列中第43位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的贻贝蛋白突变体N43Y；

将野生型地中海贻贝3B型蛋白的氨基酸序列中第76位的天冬酰胺突变成酪氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的贻贝蛋白突变体N76Y；

其中，所述野生型厚壳贻贝3型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述野生型地中海贻贝3A型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述野生型地中海贻贝3B型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.与权利要求1所述贻贝蛋白突变体相关的生物材料，其特征在于，包括如下任意一种：

a)编码如权利要求1所述突变体的氨基酸序列；

b)含有a)所述氨基酸序列的重组表达载体，具体为pet22b-Mcofp-3、pet28a-Mgfp-3A或pet28a-Mgfp-3B；

c)含有a)所述氨基酸序列的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌，具体为E.coliBL21(DE3)。

4.一种重组贻贝蛋白，其特征在于，由大肠杆菌工程菌发酵后，通过柱层析纯化所得；

其中，所述大肠杆菌工程菌为含有权利要求3中a)所述氨基酸序列的大肠杆菌工程菌，或含有权利要求3中b)所述重组表达载体的大肠杆菌工程菌。

5.根据权利要求4所述重组贻贝蛋白，其特征在于，将大肠杆菌工程菌按照1％～5％的体积比接种于LB发酵培养基中进行发酵；在菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时加入0.5～1.5mM硫代半乳糖苷诱导发酵；所述发酵的温度为15～25℃；所述发酵的转速为50～350rpm；所述发酵的时间为4～8h。

6.根据权利要求5所述重组贻贝蛋白，其特征在于，所述发酵结束后，收集菌液，离心，将所得菌体破碎，离心，所得上清液经柱层析，即得重组贻贝蛋白。

7.权利要求1或2所述贻贝蛋白突变体，或权利要求4～6中任意一项所述重组贻贝蛋白在制备生物胶粘剂中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用的体系为水溶液和/或盐溶液。

9.一种提高重组贻贝蛋白黏附力的方法，其特征在于，利用分子动力学模拟的方法理性设计，以提高贻贝蛋白的黏附性能；

所述方法为对模拟预测的贻贝蛋白三维结构优化后进行分子动力学模拟，计算模拟结束后产生结构的均方根偏差RMSD值相对于起始结构的变化值，在RMSD平衡状态下计算贻贝蛋白残基的平均溶剂可及表面积SASA，选取loop区域SASA数值最大的非酪氨酸残基，突变成酪氨酸。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)使用Amber 18进行分子动力学模拟：采用ff14SB力场获得贻贝蛋白模拟的参数，使用缓冲距离为的TIP3P水箱作为溶剂环境，并添加抗衡离子以保持系统的中性；

(2)能量最小化：使用最速下降法和共轭梯度法分两步进行能量最小化，先通过的力约束蛋白和小分子，再在无限制条件下优化整个系统；

(3)趋衡过程：在的弱约束下，将系统在300ps内从0K加热到300K，采用SHAKE算法约束氢原子的所有化学键以增加步长；

(4)实际动力学模拟：在NPT系统下进行了50ns的分子动力学模拟，模拟结果的分析采用VMD自带的RMSD计算程序计算模拟结束后产生结构的均方根偏差RMSD值相对于起始结构的变化值；

(5)在RMSD平衡时，利用MSMS程序计算了贻贝蛋白残基的平均溶剂可及表面积SASA，选取loop区域SASA数值最大的非酪氨酸残基，突变成酪氨酸。