[发明专利]提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法

说明书

本发明涉及重组蛋白领域，具体公开了一种提高β‑2微球蛋白在HEK‑293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：步骤1，活化HEK‑293细胞并传代培养，选择转染细胞；步骤2，往转染细胞中兑入培养液，稀释细胞密度；步骤3，制备转染溶液以及DNA溶液；步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液；步骤5，将转染溶液以及DNA溶液加入至含有细胞的培养液中培养；其中，培养液包括以下组分：葡萄糖；酚红；谷丙氨酸二肽；维生素C；羟乙基哌嗪乙硫磺酸；碳酸氢钠；肌醇；氯化钙；氯化钾；氯化钠；各类氨基酸；丙酮酸钠；壳寡糖；叶酸。本发明具有减少细胞代谢产物的积累、延长重组蛋白表达周期以及提高重组蛋白的表达水平的优点。

技术领域

本发明涉及重组蛋白领域，尤其是涉及一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。

背景技术

目前的蛋白来源一般包括两个方面，一方面是从动物组织中提取分离以及纯化得到的天然蛋白，另一方面则是通过质粒转染使得工程细胞携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白，形成的重组蛋白。

由于重组蛋白的活性和纯度都比天然蛋白的高，而且更易吸收，安全性也更好，目前已经得到了越来越广泛的应用。

重组蛋白的生产流程主要为细胞转染和细胞培养，转染效率是保证产量的前提，但在保证产量的前提下，细胞的生长以及代谢需求会在整个表达周期中不断增大，从而容易导致营养物质以及生长因子大量被消耗，且有毒代谢产物同时会不断积累，导致细胞可能会产生程序性细胞凋亡，进而影响蛋白在宿主细胞中的表达水平。因此，仍有改进的空间。

发明内容

为了提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中的表达水平，本申请提供一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。

本申请提供一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，采用如下的技术方案：

一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：

步骤1，取HEK-293细胞稀释传代，保证活率≥90％，并取用密度为4-6×10⁶个/mL、存活率大于98％的细胞作为转染细胞；

步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，将细胞密度稀释成3×10⁶个/mL，形成培养基，备用。

步骤3，取4-6mL转染缓冲液与500-505μL转染试剂混匀，形成转染溶液；另取4-6mL转染缓冲液与100-105μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA混匀，形成DNA溶液；

步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液，轻轻混匀，并在室温下静置10-12min，形成质粒-载体复合溶液；

步骤5，将步骤4形成的质粒-载体复合溶液逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5％的CO₂恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养；

步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，并每间隔24h添加一次；

其中，所述培养液包括以下浓度的组分：

葡萄糖70-80g/L；

酚红0.001-0.005mg/L；

谷丙氨酸二肽150-200mg/L；

维生素C 10-15mg/L；

羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5-3g/L；

碳酸氢钠100-120mg/L；

肌醇500-520mg/L；