[发明专利]一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。本发明以GH5‑5家族Bispora sp.MEY‑1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser后，可获得的甘露聚糖酶活性提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的比活力最高比突变前提高了150%，甘露聚糖酶比活力最多提高了81%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着更为广阔的应用空间，也奠定了其在工业生产领域的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。

背景技术

非淀粉多糖（non-starch polysaccharide, NSP）是植物中除了淀粉之外的碳水化合物的总称，包括纤维素、半纤维素和果胶类等。饲料纤维中含有大量的NSP，不仅会影响动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养，还严重降低了饲料的利用效率。非淀粉多糖酶，包括纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等，可以有效将饲料中的NSP降解成小分子，降低NSP的抗营养作用，提高饲料营养价值并改善动物生长性能。一般情况下，饲料中非淀粉多糖的降解需要纤维素酶、半纤维素酶（β-1,3-1,4-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶）共同作用，所以非淀粉多糖酶在饲料中需要复合使用，但这无疑增加了饲料成本，成为限制其广泛应用的一个重要因素。因此，双功能NSP酶（一种酶同时具有两种或以上功能）的研究与应用是简化饲料加工工艺、降低饲料成本的有效途径，获得功能多样性且高效的双功能酶对工业应用更是意义巨大。

催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，也是研究工作者的重点。许多单结构域的双功能酶都共享着催化通道内的催化残基与大部分底物结合位点，由于这些底物结合位点之间在功能上存在着平衡与制约，因此，双功能酶催化活性的改造存在着更大的挑战，如何有选择性的提高一种活性或者多种活性是研究者不断追求的目标。在当前的蛋白质工程领域研究中，提高催化效率的方法主要为理性设计、半理性设计与定向进化。由于随机突变具有太大的随机性，因此不适合这种精确的靶向改造。

发明内容

本发明提供了一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法。

本发明再一目的是提供双功能纤维素酶突变体。

本发明再一目的是提供双功能纤维素酶突变体的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述双功能纤维素酶突变体的应用。

本发明以GH5-5家族Bispora sp. MEY-1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser后，可获得的甘露聚糖酶活性提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的比活力最高比突变前提高了150%，甘露聚糖酶比活力最多提高了81%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着更为广阔的应用空间，也奠定了其在工业生产领域的应用前景。