[发明专利]一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法

说明书

本发明涉及一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，利用快速克隆技术，将棉铃虫CTL26克隆到pET‑28a载体，在体外获得了有活性的重组蛋白。通过显微注射的方式，对棉铃虫幼虫进行了感染实验，发现球孢白僵菌能对棉铃虫进行有效的杀伤，而使用重组CTL26处理的球孢白僵菌，对棉铃虫的杀伤效率显著提高，该蛋白为新型生物农药的研制提供了可用的靶标。本发明所涉及的棉铃虫免疫凝集素CTL26能提高球孢白僵菌对害虫的杀伤效率，具有实际的经济效益。

技术领域

本发明涉及一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，该免疫凝集素能够提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤效率，作为棉铃虫防治的靶标，属于生物技术领域。

背景技术

棉铃虫是一种广食性的鳞翅目害虫，取食包括棉花在内的200多种植物，给农业带来了巨大的损失。传统的化学农药防治方法，会使棉铃虫产生抗药性，同时造成严重的环境问题。生物防治因其对害虫的特异性和对环境的友好性，日渐成为备受关注的害虫防治策略。以球孢白僵菌为代表的虫生真菌是目前应用广泛的生物防治因子，其能够感染超过700种昆虫，同时对环境和人等温血动物无害，培养成本低，致病力强。球孢白僵菌对昆虫的感染首先要完成对昆虫体表的附着，附着后的孢子会在昆虫体表萌发，并形成附着胞，随后，真菌会分泌多种酶类（如几丁质酶、脂酶和蛋白酶等）破坏昆虫表皮的完整性，使孢子进入昆虫体内（Butt et al.，2016），并在其中繁殖，同时产生多种毒力因子，作用于昆虫的免疫、代谢等多个生理过程，使之紊乱、失调，最终引起昆虫死亡（Cen et al.，2017；Valero-Jimenez et al.，2016）。棉铃虫的免疫系统能对真菌等病原物进行识别，并将信息传递至效应细胞，产生免疫效应。免疫凝集素（CTL）是一类重要的免疫识别分子，可通过与病原表面特定糖基的相互作用，识别并结合“非己”物质，是宿主启动免疫反应的第一步。目前已知的棉铃虫CTL的功能主要表现为通过对病原物的凝集，降低其致病性，同时激活宿主的细胞免疫和体液免疫，诱发包囊和吞噬反应，诱导抗菌肽的表达，对病原进行一定程度的杀伤，从而降低真菌等病原物对宿主的危害，保证宿主存活（Wang et al.，2017；Cheng et al.，2017）。本发明所涉及的免疫凝集素能显著提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤力，在保证安全的情况下，增强现有生物农药对害虫的杀灭效果，可以降低农药的使用量，节省农业生产的成本。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在的问题，利用快速克隆技术，将棉铃虫CTL26克隆到pET-28a载体，在体外获得了有活性的重组蛋白，通过感染实验，发现重组CTL26能显著提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤效率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤（1）、获得pET-28a-CTL26原核表达载体；

提取棉铃虫的脂肪体总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，所用上游引物序列为GCATGACTGGTGGACAGAAGCCTGATTACTTGTACGA，下游引物序列为CTAGTTATTGCTCAGCGGTTTCTGTGTAGATCTTCCAAA，得到的目的片段；经测序后确定为CTL26；然后，利用无缝克隆方法，获得pET-28a-CTL26原核表达载体；

步骤（2）、将pET-28a-CTL26原核表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，挑取单菌落，转接培养，加入IPTG诱导，离心得到含有CTL26蛋白的上清液，经Ni亲和层析柱纯化和超滤提纯后，获得变性的CTL26重组蛋白。