[发明专利]一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法

权利要求书

1.一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤（1）、获得pET-28a-CTL26原核表达载体；

提取棉铃虫的脂肪体总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，所用上游引物序列为GCATGACTGGTGGACAGAAGCCTGATTACTTGTACGA，下游引物序列为CTAGTTATTGCTCAGCGGTTTCTGTGTAGATCTTCCAAA，得到的目的片段；经测序后确定为CTL26；然后，利用无缝克隆方法，获得pET-28a-CTL26原核表达载体；

步骤（2）、将pET-28a-CTL26原核表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，挑取单菌落，转接培养，加入IPTG诱导，离心得到含有CTL26蛋白的上清液，经Ni亲和层析柱纯化和超滤提纯后，获得变性的CTL26重组蛋白；

步骤（1）中，获得的CTL26的cDNA序列如下：ATGTTAACAATATATTTAATTTGTTTGTCATATTTGTTGATTGCAACTGGTCCCGTGCGATGCAAGCCTGATTACTTGTACGACAGTGAAGTGCAGGGCTGGCTCAAGCTTCACGTGATTCCAGCAACGTGGGAGCAAGCGGTTTTGCGCTGTCACTATGAAGGAGCAGTGCTGGCGTCTCCACTTAACGAAGAGCTGACCAAAGCTCTCCACTCAACAATGACAAAGTTTGGTATCAATCGTTGCATCTTCTTGGGTACCAGTTTGTTGCTCTCCAATGGCGACTTCGTTTCAATAGAAGGCGTCCCACTGTCTGACCAGGAGATACAGTGGAGCCCACAAGGGCCCGATCCAGGACAATGCCTCACCATGGCCATCTCTGGCAGCGAGCACTTCATGTATACCGCGTCATGCGACGAACAACTACCCTACATATGCTATAGAAATCATGACAATAGTACTATGAATGAATGTGGCACATTTGACAACAAATACCACTACAATCAGAAAACTGGCAGCTGTTACAAAGTCCACAACGAGAAACACACCTGGTACCGCGCAAATATGATCTGCTTTGCGGAGGGAGGTCATCTCGTCATCCTGAATGATGACGTGAAAGCTAACATCGTCAAGGATATGTTCCCCGTTCGTACCGATAACACGACGAATTTATGGGAGCAAATCCACATCGGTCTAAAAGCCTGGGACGACCGCATATGGTTTACCATTCACGGTGATAAAATAGACGATGTGTACAACCAATGGGCTGCAGGACAACCAGACAATAAGATGGGCACACAAAATATTGGTACTATTCTTCGGAGTGGCCTCTTGGATGATGCAAATCCTCTCAAACGGAACATGTTTGTGTGCGAGAAAGCAGCTCATAAAATACGCTTCGAATCTCCAAAATTGCGATGGAATGAATTAATTGTACCTTTTGGAAGATCTACACAGAAATAA；

以上cDNA序列对应的蛋白质序列如下：

MLTIYLICLSYLLIATGPVRCKPDYLYDSEVQGWLKLHVIPATWEQAVLRCHYEGAVLASPLNEELTKALHSTMTKFGINRCIFLGTSLLLSNGDFVSIEGVPLSDQEIQWSPQGPDPGQCLTMAISGSEHFMYTASCDEQLPYICYRNHDNSTMNECGTFDNKYHYNQKTGSCYKVHNEKHTWYRANMICFAEGGHLVILNDDVKANIVKDMFPVRTDNTTNLWEQIHIGLKAWDDRIWFTIHGDKIDDVYNQWAAGQPDNKMGTQNIGTILRSGLLDDANPLKRNMFVCEKAAHKIRFESPKLRWNELIVPFGRSTQK。

2.根据权利要求1所述的一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，其特征是，还包括对获得的变性的CTL26重组蛋白进行复性与活性检测的步骤，其步骤为：

首先，使用透析袋和蛋白复性溶液对变性的CTL26重组蛋白进行多次梯度复性，获得可溶性蛋白；最后，通过凝集、结合和包囊实验分析其对球孢白僵菌的识别活性。