[发明专利]一种用于提高基因敲除效率的方法

说明书

一种用于提高基因敲除效率的方法，本发明涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。本发明的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，本发明针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围使用多个高效sgRNA(约3‑6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。这将显著的提高基因敲除效率，本发明应用于CRISPR‑Cas9介导的基因组编辑领域。

技术领域

本发明涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。

背景技术

相对于传统的ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcriptionactivator-like effector nucleases)基因编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，由于它的高效便捷的优势，目前已在众多基因治疗和生命科学研究中扮演者重要的角色。而现有的CRISPR/Cas9除了存在脱靶效应和sgRNA靶向位置依赖基因组中的PAM位点外，还有基因敲除效率不高等问题。如果敲除效率低会导致基因敲除后的细胞基因改变频率低，只有极少的细胞发生了基因敲除。对于细胞群体而言等于没有明显的细胞功能变化，从而对于细胞功能的研究和细胞的功能改变大大降低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，提供一种用于提高基因敲除效率的方法。

本发明一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：

一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；

二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；

三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；

四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；

五、目的细胞培养24-48h小时后，检测细胞基因敲除效率。

本发明的有益效果为：

本发明针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围设计多个高效sgRNA(3-6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。基因编辑效率的高低与所使用的sgRNA具有显著相关性。单个sgRNA的基因敲除效率是固定且有限的。同时导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。

附图说明

图1为NCBI检索图；

图2为PCR引物和sgRNA设计的示意图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：

一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；

二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；

三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；