[发明专利]一种用于提高基因敲除效率的方法在审
| 申请号： | 202111289215.6 | 申请日： | 2021-11-02 |
| 公开（公告）号： | CN114032240A | 公开（公告）日： | 2022-02-11 |
| 发明（设计）人： | 王小方;孔明圣;门增轩 | 申请（专利权）人： | 珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90;C12N15/12 |
| 代理公司： | 哈尔滨市松花江专利商标事务所 23109 | 代理人： | 李红媛 |
| 地址： | 519000 广东省珠海市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 提高 基因 效率 方法 | ||
1.一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；
三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
五、目的细胞培养24-48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
2.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于目的基因序列片段为目的基因位点前50bp-目的基因位点后50bp。
3.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于目的基因序列片段为BCL11A基因第58号增强子序列。
4.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤一中合成sgRNA的方法为体外制备。
5.根据权利要求4所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于体外制备sgRNA的方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化sgRNA。
6.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤一中合成sgRNA的方法为化学合成。
7.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤四中将多个Cas9/sgRNA蛋白复合物按照等体积、等浓度混合。
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