[发明专利]用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒

说明书

本发明公开了用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒。所述选自pUS20D9M,pUS20XP1以及pUS20XP2中的任意一个；其中，质粒pUS20D9M序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pUS20XP1序列如SEQ ID NO.2所示，质粒pUS20XP2序列如SEQ ID NO.3所示。枯草杆菌是一种重要的微生物。很多育种工作需要提高枯草杆菌的基因突变频率。然而，目前尚缺乏理想的控制枯草杆菌自发突变频率的方法。本发明借助CRISPRi技术和过表达易错型DNA聚合酶的方法，提高宿主的自发突变频率(最高达5128倍)。整个操作可通过质粒的转化和消除实现，无需对宿主进行基因敲除。

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了用于提高枯草芽孢杆菌自发突变率的质粒。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵工业、农业和环境保护等领域都发挥重要作用。比如枯草芽孢杆菌被用于重组蛋白表达、化合物生产、植物促生、生物防治和污染物降解等。在实际应用之前，通常要对菌株进行驯化和改造，即育种。物理或化学诱变是常用的育种方法，即通过物理或化学手段提高菌株的基因突变频率，然后筛选目标突变株。该方法的缺点是突变效率低和突变谱窄，且存在危险和污染问题。因此，科研人员尝试提高菌株的自发突变频率。具体策略包括敲除菌株的错配修复系统和表达易错型DNA聚合酶等等。然而，理想的方法应该是不改变宿主的基因型，实现可拔插式操作。迄今，枯草芽孢杆菌中尚无这种理想型的突变方法。鉴于此，本发明提供可以提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒，导入质粒即可提高宿主的基因突变频率，丢失质粒后宿主的基因突变频率则恢复正常。该质粒可以应用于枯草芽孢杆菌的育种。

发明内容

技术问题：枯草芽孢杆菌是一种重要的微生物，突变育种在该菌的应用中发挥重要作用。然而，物理和化学诱变育种存在突变效率低、突变谱窄以及危险性高等问题。虽然体内自发突变比体外诱变安全，但目前枯草芽孢杆菌中尚无提高自发突变频率的理想方法。本发明借助 CRISPRi(CRISPR interference)技术和过表达易错型DNA聚合酶的方法，提高宿主的自发突变频率。整个操作可通过质粒的转化和消除实现，无需对宿主进行基因敲除。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明所述的质粒可用于提高枯草芽孢杆菌的自发突变频率，进而对枯草芽孢杆菌进行育种。

用于提高枯草芽孢杆菌自发突变频率的质粒，其特征在于，选自pUS20D9M,pUS20XP1以及pUS20XP2中的任意一个；其中，质粒pUS20D9M序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pUS20XP1 序列如SEQ ID NO.2所示，质粒pUS20XP2序列如SEQ ID NO.3所示。

上述质粒均用于提高枯草芽孢杆菌自发突变率。该系列质粒主要功能元件是木糖诱导的 dCas9表达盒，木糖诱导的失去校对功能的polC^*表达盒，以及干扰mutSL和polC的两个sgRNA 表达盒。