[发明专利]一种提高干细胞外泌体产量的培养液

说明书

本发明公开了一种提高干细胞外泌体产量的细胞培养液，属于细胞培养技术领域。该培养液包括以下组分：组分1：基础培养液；组分2：血清和/或血清替代品；组分3：炎症因子；组分4：活性多肽；组分5：细胞信号通路抑制剂。本发明提供的培养液能够促进脐带间充质干细胞囊泡的形成，通过激活SIRT1基因活性，进而提高脐带间充质干细胞外泌体的产量。该培养液中，白介素‑6、磷酸化MARCKS Peptide和Quercetin D5对提高脐带间充质干细胞外泌体产量发挥了协同增效的作用。本发明提供的培养液原料易得，制备方法简单，成本低廉，在制备高产量的外泌体中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高干细胞外泌体产量的培养液。

背景技术

外泌体来源于晚期内吞体(也称多囊泡体，multivesicular bodies，MVB)的囊泡，是细胞内吞泡膜向内凹陷形成含有多个小囊泡的多囊泡体，这种多囊泡体与细胞膜融合，释放到细胞外基质中成为一种直径约30～100nm的膜性囊泡。外泌体最早由Johnstone等在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现。后来研究发现，不仅网织红细胞能释放这种小囊泡，几乎所有类型的活细胞都能分泌外泌体。

外泌体中含有DNA片段、mRNA、小RNA、功能蛋白及转录因子等多种具有生物活性的物质，其膜结构还表达多种抗原、抗体分子，能产生各种生物学效应，从而在临床治疗疾病中具有广泛的应用前景。外泌体的组成与其细胞来源有关，不同细胞来源的外泌体所含具体成分不尽相同。

干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，是一类具有自我复制能力和多向分化潜能特性的细胞。自1968年第一次骨髓细胞移植治疗成功以来，以细胞疗法为代表的再生医学被应用于许多疾病的治疗。在心血管疾病领域，尤其是心肌梗死的治疗中，干细胞疗法表现出了巨大的潜力。研究表明，干细胞疗法可以促进心肌细胞的存活，从而改善心肌收缩力以治疗心血管疾病，尤其是心肌梗死。然而，细胞疗法具有一定的局限性，其移植成功率低、具有免疫排斥性和致瘤性等风险都限制了其临床应用。近年来的研究表明，干细胞除了可诱导分化为心肌细胞以修复梗死组织外，还可以通过外泌体的旁分泌机制参与修复受损心肌组织。因此，外泌体有望取代干细胞疗法成为治疗心血管疾病尤其是心肌梗死的新方法。

人脐带间充质干细胞分离于新生儿出生后的废弃组织——脐带，是一类具有多向分化能力和自我更新能力的干细胞。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于人脐带间充质干细胞的提取。同时，人脐带间充质干细胞的体外扩增和多向分化能力比其他组织来源的干细胞更强。研究发现，人脐带间充质干细胞来源的外泌体能够抑制外周血淋巴细胞的增殖，降低其分泌细胞因子IL-4和INF-y的水平，还能抑制血液系统肿瘤细胞的生长，促进其凋亡，说明人脐带间充质干细胞来源的外泌体具有良好的免疫抑制作用和抑瘤作用，在临床上用于抗炎和抗肿瘤的药物中具有广阔的应用前景。

目前，提取外泌体的方法主要包括密度梯度离心法，有机溶剂法，免疫亲和层析法，免疫磁珠法，液相色谱分离法，差速超速离心法等。其中，密度梯度离心法提取外泌体被认为是相对经典的方法，但其操作繁杂，耗时长，不便于临床应用，有研究表明，将外泌体悬浮于30％蔗糖/重水垫中进行纯化，然而密度梯度离心法属于等密度离心范围，没有密度梯度差，因而容易混有其他密度的杂质，同时，重水对人体是否有影响尚不能评定。有机溶剂法是相对较原始的方法，虽然操作比较简单、成本较低，但是专一性不高，不仅能沉淀高丰度的蛋白质，也会连同部分低丰度的蛋白质一起沉淀。免疫亲和层析法的特异性强、效率高，但是操作过程比较复杂。免疫磁珠法与液相色谱分离法成本较高，不能普及。差速超速离心法是根据样本中各物质沉降所需离心力不同的原理来提取外泌体的方法，尽管差速超速离心法耗时稍长，但是不存在未知的潜在杂质污染，并且纯度相对较高，成本也比较低，可以大量地提取，满足实验的基本需求，在实际应用中，重复性高，可作为一种合理的分离方法。