[发明专利]热稳定性提高的胰蛋白酶突变体

说明书

本发明公开了热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明在高酶活灰色链霉菌胰蛋白酶基础上，通过定点突变生物技术改造胰蛋白酶分子结构，分析了SGT的柔性区域，并通过半理性设计最终获得两株热稳定性与比酶活提高的突变菌株S40P，Q124P。这些突变体能够在较高温度下进行工业生产，利于生产工艺的灵活性，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及比酶活与热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

胰蛋白酶作为一种多肽水解酶能够专一性地切割肽链中精氨酸或赖氨酸的羧基端，是工业用蛋白酶的重要组成部分，其消耗量约占工业酶制剂市场的3％。胰蛋白酶在皮革加工、医药领域、食品加工以及农业领域都有广泛的应用前景。

胰蛋白酶是皮革加工过程中的重要酶制剂之一，应用于皮革的浸水、脱毛、局部处理与脱灰软化的步骤。而胰蛋白酶特异性分解蛋白质的特性使其具有促进脓液、痰液、血凝块分解溶化的功能，同时血清中含有的胰蛋白酶抑制剂能防止或抑制胰蛋白酶对正常组织造成损伤。此外胰蛋白酶还可以作为工具酶，用于切割基因工程生产的人胰岛素前体，生产具有活性的成熟胰岛素。在食品加工领域胰蛋白酶可用于水解各类动植物蛋白也可以在保健食品以及食品添加剂行业中用于增强乳清蛋白的胶凝性、热稳定性和乳化性等性质。此外胰蛋白酶还是多肽质谱、蛋白组学分析的重要工具酶。

异源表达微生物来源的灰色链霉菌胰蛋白酶(SGT)能够避免动物来源胰蛋白酶的免疫原性等问题具有重要的应用价值。与常用的商品化猪源胰蛋白酶和牛源胰蛋白酶相比，SGT具有更显著的切割效率。但是，目前包括SGT在内的各类胰蛋白酶的热稳定性都很差，极易失活，无法应用于高温的生产条件。

目前对于SGT异源分泌表达过程中稳定性差的问题，还没有很好的解决方案。如果能够提升SGT在异源表达中的稳定性，将能显著提高该酶的生产应用价值，更有助于工业化生产。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了热稳定性提高的胰蛋白酶突变体，以及能够表达所述胰蛋白酶突变体的毕赤酵母工程菌。

前期研究工作中，发明人已获得一种高酶活的胰蛋白酶重组毕赤酵母工程菌，该酵母菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的胰蛋白酶(称其为WT1)，编码所述胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在亲本氨基酸的基础上对其进行了适当的突变，从而获得了稳定性、酶活提高的突变体，为胰蛋白酶在产业上的应用提供了广阔的前景。

本发明提供了胰蛋白酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的胰蛋白酶为亲本，分别将其第40位或124位的氨基酸进行突变。

在一种实施方式中，编码所述亲本的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，将亲本第40位丝氨酸突变为脯氨酸。

在一种实施方式中，将亲本第124位谷氨酰胺突变为脯氨酸。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带权利要求3所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体为pPIC9k、pHIL-S1、pPICZA、Pyam75p6中的任意一种。

本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为毕赤酵母GS115、KM71、KM71H和/或X33。

本发明提供了一种提高胰蛋白酶热稳定性的方法，所述方法为将胰蛋白酶的第40位氨基酸突变为脯氨酸，或第124位氨基酸突变为脯氨酸。