[发明专利]一种提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法

说明书

本申请属于园艺技术领域，具体涉及一种标准化的提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法。该组培方法适用于转基因遗传转化时的矮牵牛的组培应用，具体包括外植体选择、制备浸染液、叶片浸染及共培养、筛选培养、生根培养及炼苗移栽等步骤。本申请中，以特定质粒构建为例，对矮牵牛遗传转化过程中对于影响遗传转化效率的相关组培技术的关键因素进行了探讨和优化，基于此，可为相关遗传转化过程中的标准化操作、标准化组培体系构建奠定一定技术基础，进而可为矮牵牛相关遗传转化体系构建、矮牵牛新品种培育奠定一定技术基础，因此具有较好的科研价值和实用意义。

技术领域

本申请属于园艺技术领域，具体涉及一种标准化的提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法。

背景技术

矮牵牛（Petunia hybrida (J. D. Hooker) Vilmorin）是一种应用非常广泛的花坛、花镜植物，也是研究观赏性状（花色、花香、花型等）的一种理想模式植物，具有如下优点：（1）生命周期短，3个月左右即可完成从种子萌发到开花的整个过程，一年中可以生长4代左右；（2）扦插、组培等无性繁殖简单，繁殖效率较高；（3）矮牵牛P .inflata和P. axillaris已完成基因组测序工作，为开展比较基因组研究提供了十分有利的条件，是研究基因功能的良好材料。

矮牵牛作为一种观赏性状研究的模式植物，早在上世纪80年代就成功建立了转基因技术体系。现有矮牵牛转基因的主要方式是：基于叶片诱导愈伤组织的遗传转化方法。具体操作时，选用的遗传转化材料可以来自于室外培养的矮牵牛植株（温室或培养室），亦可选用组织培养诱导的矮牵牛植株。但是，现有矮牵牛遗传转化操作时，所采用的遗传转化的材料以叶片为主，材料类型的限制使得实际转化效率、转化效果与叶片生长状态显著相关；另一方面，由于选用的叶片缺乏统一的标准，叶片大小和厚度不一等原因，造成后续遗传转化效率参差不齐。因此，稳定、高效的矮牵牛遗传转化体系是开展相关转基因和基因编辑研究的重要前提保障。

发明内容

本申请目的在于提供一种相对标准化的矮牵牛组培方法，基于该培养方法所获得的组培材料，可为矮牵牛的稳定遗传转化体系构建奠定一定技术基础。

本申请的技术方案详述如下。

一种提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，该组培方法适用于转基因遗传转化时的相关矮牵牛品系的组培应用，具体包括如下步骤：

（一）外植体选择

以矮牵牛幼苗上叶位位于第3片叶至7位叶片为材料，消毒灭菌后，分切成合适大小叶块作为组培用外植体；

所述矮牵牛品种为M1×R27；

所述叶块规格为：长方形，长度大小在3-10mm（优选6-8mm），叶片的主叶脉需尽量保留；

消毒灭菌方式为：先在70%的酒精中灭菌5s，然后用无菌水冲洗3次；之后用0.5%的次氯酸钠灭菌8-10min，再用无菌水冲洗5次；

（二）制备浸染液

将含有目的基因的重组质粒（重组表达载体）转化至农杆菌，制备遗传转化用浸染液；

所述浸染液，为OD ₆₀₀=0.4-0.6的农杆菌菌液+10 µl、25mg/ml乙酰丁香酮；

所述目的基因，例如为矮牵牛R2R3-MYB家族基因的ASR1基因；对应的，重组质粒为含有ASR1基因的重组超表达载体、或者用于沉默ASR1基因的RNAi载体；

重组超表达载体以质粒V137为骨架进行重组构建；

用于沉默ASR1基因的RNAi质粒以V139为骨架进行重组构建；

具体构建时，利用gateway技术，将目的基因ASR1基因先与入门载体pDNOR207进行连接，再通过LR反应连接至超表达载体V137或RNAi载体V139；