[发明专利]一种提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法

权利要求书

1.一种提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，该组培方法适用于转基因遗传转化时的矮牵牛的组培应用，具体包括如下步骤：

（一）外植体选择

以矮牵牛叶片为外植体来源，消毒灭菌后，分切成合适大小叶块作为组培用外植体；

（二）制备浸染液

将含有目的基因的重组质粒转化农杆菌，制备遗传转化用浸染液；

（三）叶片浸染及共培养

将步骤（一）中分切后叶块置于步骤（二）的浸染液中浸染；然后置于共培养培养基上培养1.5-2d；

所述共培养基为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，pH值为5.7；

共培养条件为：黑暗条件，25-30℃条件下进行培养；

（四）筛选培养

将步骤（三）中共培养后的遗传转化材料，转接至筛选培养基中进行培养筛选；培养时间为40-60d；

培养过程中，依据培养体长势调整相关操作，具体而言：

将筛选培养期间获得的小芽转移至筛选培养基中进一步培养以使小芽长大；

将没有获得小芽的遗传转化材料进一步转接至增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养时间20-30d；随后，将增殖培养后获得的小芽转入生根培养基中培养；

所述筛选培养基为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1mg/L 玉米素+2mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，并添加抗生素，pH值为5.7；

所述增殖培养基，具体为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+2mg/L 玉米素+1mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，并添加抗生素，pH值为5.7；

筛选培养条件为：光照强度2000~12000 Lux，光周期为光照12h，黑暗12h；温度25-30℃；

营养生长时，用于遗传转化的矮牵牛材料的培养条件为：3000~15000Lux光照条件下，光周期为光照12h，黑暗12h；温度25-30℃、湿度50%-60%条件下生长；

（五）生根培养及炼苗移栽

对上述步骤（四）中获得的矮牵牛遗传转化后代，切取含有芽部的培养体，转接到含有生根培养基上进行诱导生根培养；生根培养时间20-40d；

所述生根培养基配方为：1/2MS +20g蔗糖+10g葡萄糖，并添加抗生素；

最后，将生根后的矮牵牛转化植株移栽后继续培养成苗。

2.如权利要求1所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（一）中，所述矮牵牛品种为M1×R27。

3.如权利要求1所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（一）中，所述叶块规格为：长方形，长度大小在3-10mm，叶片的主叶脉需保留。

4.如权利要求1所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（一）中，消毒灭菌方式为：先70%的酒精中灭菌5s，然后用无菌水冲洗3次；之后用0.5%的次氯酸钠灭菌8-10min，再用无菌水冲洗5次。

5.如权利要求1所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（二）中，所述浸染液，为OD ₆₀₀=0.4-0.6的农杆菌菌液+10 µl、25mg/ml乙酰丁香酮；

所述目的基因，为矮牵牛R2R3-MYB家族基因的ASR1基因；对应的，重组质粒为含有ASR1基因的重组超表达载体、或者用于沉默ASR1基因的RNAi质粒。

6.如权利要求5所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（三）中，将步骤（一）中分切后叶块置于步骤（二）的浸染液中浸染10-15min。

7.如权利要求1所述提高矮牵牛遗传转化效率的组培方法，其特征在于，步骤（四）中，用于遗传转化的矮牵牛材料的培养条件为：12000Lux光照条件下，光周期为光照12h，黑暗12h；温度25-30℃、湿度50%-60%条件下生长。