[发明专利]一种提高细胞成活率的鸡小黄卵泡膜细胞的体外培养方法

说明书

本发明公开一种提高细胞成活率的鸡小黄卵泡膜细胞的体外培养方法，涉及生物工程技术领域；所述方法具体为：将鸡小黄卵泡的膜层与胶原酶混合进行消化，消化后过滤得到细胞悬液；将获得的细胞悬液离心，获得的沉淀即为鸡小黄卵泡膜细胞；将获得的鸡小黄卵泡膜细胞与细胞培养液混合培养，得到鸡小黄卵泡膜细胞系；利用本发明所述的体外培养方法可以在较短的时间内获得大量的鸡小黄卵泡膜细胞，成活率较高，达到95％以上，保证了鸡小黄卵泡膜细胞后续试验的顺利进行。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种提高细胞成活率的鸡小黄卵泡膜细胞的体外培养方法。

背景技术

母鸡卵巢和卵泡的发育是一高度协调的复杂生理过程，受各种内分泌、旁分泌和自分泌的调控。在性成熟的母鸡卵巢内，存在着各个发育阶段的卵泡，卵泡发育的初期阶段，卵母细胞周围的体细胞分化并紧密结合在一起，发育为原始颗粒细胞，由此原始卵泡开始形成。当原始卵泡被选择发育为初级卵泡后，间质细胞分化为膜细胞层。颗粒细胞和膜细胞被非细胞成分组成的基膜隔开，有效阻止了血液和颗粒细胞的直接接触。白卵泡初期只有一层颗粒细胞，发育到后期分为两层，到黄卵泡时期颗粒细胞变为多层，而发育为等级卵泡时又逐渐变为一层细胞。而单层膜细胞最终发育为形态和功能具有明显差别的各具多层细胞的内外两层膜。卵泡由卵母细胞和包裹在外面的颗粒细胞以及膜细胞组成，根据大小可以大概分为等级前卵泡和等级卵泡，其发育和排卵遵循着严格的等级制度，F1是即将排卵的卵泡，其次是F2、F3等，当F1排卵以后，就会从6-8mm的小黄卵泡中选择一个进入等级卵泡发育阶段。因此处于6-8mm发育状态的卵泡是卵泡筛选中能否进入等级卵泡的关键点。卵泡膜细胞主要产生黄体生成素，具有促进胆固醇在体内转化为性激素的作用，同时与促卵泡激素共同作用下促进卵泡成熟，分泌雌激素，促进卵巢排卵，以及卵巢排卵后产生黄体和维持黄体的功能作用。卵泡膜细胞还会产生雄性激素，而雌性激素可促进卵泡的成熟发育，然后到排卵期之后，使成熟卵泡排出体外，而形成卵子的作用。因此卵细胞是体外研究卵泡发育调控机理的理想模型。

现研究报道中，未见到鸡小黄卵泡膜细胞体外培养的报道，因此，建立有效的分离、纯化和培养方法，是鸡卵泡膜细胞应用的前提条件,如何将膜细胞高效分离，纯度高，且价格低廉，易于推广，对更深入研究家禽种质资源特性与探究卵泡发育调控机理有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高细胞成活率的鸡小黄卵泡膜细胞的体外培养方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种提高细胞成活率的鸡小黄卵泡膜细胞的体外培养方法，所述体外培养方法具体为：

(1)将离体的鸡小黄卵泡的膜层与胶原酶混合进行消化，消化后过滤得到细胞悬液；

(2)将步骤(1)获得的细胞悬液离心，获得的沉淀即为鸡小黄卵泡膜细胞；

(3)将步骤(2)获得的鸡小黄卵泡膜细胞与细胞培养液混合培养，得到鸡小黄卵泡膜细胞系。

进一步地，所述离体的鸡小黄卵泡的膜层的制备方法为：去除鸡小黄卵泡的颗粒层，获得所述鸡小黄卵泡的膜层。

进一步地，所述胶原酶为II型胶原酶。

进一步地，所述离体的鸡小黄卵泡的膜层为破碎的鸡小黄卵泡的膜层。

进一步地，所述细胞培养液由胎牛血清、鸡血清、DMEM和双抗以2：8:0.001的体积比配置而成。

进一步地，所述双抗为青霉素和链霉素。

进一步地，所述青霉素工作浓度为100U/ml；所述链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

本发明公开了以下技术效果：利用本发明所述的体外培养方法可以在较短的时间内获得大量的鸡小黄卵泡膜细胞，成活率较高，达到95％以上，保证了鸡小黄卵泡膜细胞后续试验的顺利进行。

具体实施方式