[发明专利]从二代测序数据挖掘植物ITSs序列并用于鉴别品种家系

说明书

本发明提供了一种通过二代测序数据准确组装个体内ITS不同单倍型的方法,包含以下步骤：1)制备待测样本总DNA的二代测序文库；2)将所述二代测序文库进行测序，得到测序数据；3)将所述测序数据分别进行ITS1、ITS2序列拼接和注释。本发明还公开了该方法组装得到的ITSs序列。本发明还提供了进一步的应用，包括使用该ITSs序列及对应的叶绿体基因组序列作为指纹鉴别样本的家系。对食用玫瑰，本专利能够直观的判断食用玫瑰品种的双亲来源及食用玫瑰品种之间的遗传关系，不仅能够准确快速鉴定品种及家系，还能为待测品种的育种途径和可能的改良方向提供重要的指导信息。

技术领域

本发明涉及一种使用二代测序数据挖掘ITSs序列并用于分析鉴别品种家系的方法。

背景技术

食用玫瑰属于蔷薇科蔷薇属(Rosa L.)植物，是一类以鲜花入食的蔷薇属植物的统称。在我国主要以新鲜或者干燥花瓣用于食品加工，以作为色素、香味、维生素等的来源。在国内主要产品形式有干燥玫瑰花蕾、玫瑰酱、玫瑰糖、玫瑰酒、玫瑰饼、玫瑰露等。国家食品安全标准与监测评估司发布的《关于批准DHA藻油、棉籽低聚糖等7种物品为新资源食品及其他相关规定的公告(2010年第3号)》，文件明确玫瑰花(‘重瓣红玫瑰’Rosa rugosa‘Plena’)作为普通食品生产经营。然而这一规定仅明确了‘重瓣红玫瑰’一个品种的食用合法性。根据文献调查和实地调查，国内各地引种栽培的油用玫瑰品种开拓应用范围到食用领域，这些品种包含国际精油用‘大马士革’、山东平阴玫瑰研究所培育的‘紫枝玫瑰’和‘丰花玫瑰’、甘肃的‘苦水玫瑰’等。到底哪些是符合国家新食品资源标准的品种，可以被合法的用于食品加工，而其他种类的食用是否存在一定的风险，都是亟待解决的问题。

在植物学种的概念上，根据植物志记载，我国野生的玫瑰为蔷薇科蔷薇属的一个物种(Rosa rugosa Thunb.)。‘重瓣红玫瑰’被认为是野生玫瑰的重瓣栽培品种。然而这一关系并没有遗传方面的证据。

蔷薇属栽培品种由于杂交频繁，形态相似度高，传统基于形态学进行品种区分难度较大。国内目前主要使用的食用玫瑰品种有约20种，然而这些被用作食用玫瑰的品种缺乏背景资料记载，不同栽培区相互引种，且常出现同物异名的现象，对食用玫瑰品种的选择、新品种培育及整个食用玫瑰产业的健康发展极为不利。而近些年来，被称为玫瑰的品种越来越多，这些被称为玫瑰的品种与野生种玫瑰以及‘重瓣红玫瑰’的关系尚不清楚。理清玫瑰的家系对于玫瑰品种的选择利用、新品种培育以及玫瑰市场的健康发展至关重要。国内对于玫瑰品种的区分和鉴别做了一些尝试，然而并没有提供一个清晰的玫瑰家系，不同玫瑰的来源和遗传背景仍然不清楚，市场上玫瑰品种依旧很混乱。

以往发表的区分物种或者品种的方法，基于限制性片段多态性或者扩增片段多态性的实验重复性差，且获取的关系往往不够直接；基于少量叶绿体片段的，信息量太少，鉴别能力有限，且只能提供母系遗传的信息；基于少量单拷贝核基因片段的，由于多数单拷贝核基因在物种内的变异度较大，需要较多的居群采样，才能代表一个物种，且单拷贝核基因在基因组内的只有一个拷贝，引物设计和扩增难度较大，失败率高。

核糖体基因在植物单个细胞内的拷贝数很多，成百上千。核糖体基因(rDNA)转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)序列在植物种属关系研究中得到广泛的使用，然而一般认为ITS序列在个体内会经历同质性进化，从而实现个体内不同拷贝的ITS序列保持高度一致，因此ITS的应用一般停留在野生植物属下种间的关系研究上。对于植物内ITS序列多样性及其应用的报道较少见。一些研究蔷薇属栽培品种起源的研究，尝试了ITS序列的适用性，然而克隆测序实验繁琐且价格昂贵，而由于采用传统通过PCR测序获取ITS序列的方法不能得到同一个体内的不同单倍型，未能得到理想的效果。以往利用叶绿体基因组单个基因片段或者数个基因联合片段作为种间关系研究的尝试也只能得到较低的分辨率，并且由于母系遗传，叶绿体基因或叶绿体基因组对于同一母本种下的品种没有区分能力。

发明内容