[发明专利]一种基于低共熔溶剂提高全细胞制备D-阿洛酮糖催化效率的方法

说明书

本发明公开了一种基于低共熔溶剂提高全细胞制备D‑阿洛酮糖催化效率的方法。本发明提供了一种以表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA的大肠杆菌BL21/DPE‑XYLA全细胞为催化剂催化D‑葡萄糖制备D‑阿洛酮糖的方法，并辅以含有氯化胆碱为组成之一、以甘油、尿素、乙二醇为第二组成部分的低共熔溶剂/磷酸缓冲液体系，大大提高了D‑阿洛酮糖得率。本发明的利用低共熔溶剂的方法对提高全细胞制备D‑阿洛酮糖催化效率具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种基于低共熔溶剂提高全细胞制备D-阿洛酮糖催化效率的方法。

背景技术

稀有糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其在膳食、保健、医药等领域中具有重要的潜在应用价值。D-阿洛酮糖，为果糖C-3异构体，是一类重要的稀有糖，其甜度是蔗糖的70％，而热量仅为后者的0.3％，是蔗糖的良好替代品。动物实验证明D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，包括1)能降低血糖，可作为II型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；2)能降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积等。D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，2011年被美国食品及药品管理局(FDA)批准为GRAS(一般认为安全，Generally Recognized as Safe)食品，允许应用于医药制剂、食品、膳食补充剂等领域，具有广阔的开发前景及优良的应用价值。

生物法催化制备D-阿洛酮糖具有反应条件温和、能耗低、选择性高等优点。DPE可催化D-果糖与D-阿洛酮糖的C3位羟基的差向异构反应，目前常被用于D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖。已在多个微生物细胞，包括Rhodobacter sphaeroides SK011、Clostridiumcellulolyticum H10、Ruminococcus sp.、Clostridium scindens、Desmospora sp.、Doreasp.CAG317、Treponema primitia、Arthrobacter globiformis M30与Paenibacillussenegalensis等中发现DPE编码基因的存在，研究人员通过PCR方法克隆得到这些基因序列并将其在表达宿主中获得进行异源表达，以获得含有DPE重组蛋白的全细胞作用生物催化剂，用于催化D-果糖转化D-阿洛酮糖的制备。在该反应的前端加上XYLA催化以D-葡萄糖底物异构化为D-果糖的反应，形成双酶级联反应，并以更为常见的D-葡萄糖为底物制备D-阿洛酮糖，对于稀有糖的低成本制备提供一条可行性路径。

含有重组蛋白的全细胞催化制备D-阿洛酮糖的过程具有操作简单、成本低等优点，然而，重组蛋白DPE与XYLA的细胞内表达涉及到底物主动运输过程，会导致催化剂与底物的接触延迟，此外，细胞优先利用D-葡萄糖底物进行生理代谢，导致底物损失与转化效率降低。加快细胞内的酶蛋白与D-葡萄糖的识别，将对促进全细胞催化反应效率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于在全细胞制备D-阿洛酮糖的催化体系中加入一定量低共熔溶剂，达到提高全细胞催化效率、提高D-葡萄糖的转化率，从而降低D-阿洛酮糖生产成本。低共熔溶剂是一类制备简单便宜、毒性低、溶解性好、环保安全的绿色溶剂，在催化领域具有巨大的应用潜力。

本发明的基于低共熔溶剂提高全细胞制备D-阿洛酮糖催化效率的方法，包括以下步骤：

将低共熔溶剂与相应缓冲液混合作为催化体系，加入表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA的重组菌株作为催化剂，催化转化D-葡萄糖为D-阿洛酮糖。

优选，所述的低共熔溶剂为氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/尿素、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/木糖、氯化胆碱/乙酰胺、氯化胆碱/乙醇和氯化胆碱/咪唑中的至少一种。