[发明专利]一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法

说明书

本发明涉及一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法，属于组织切片制备与外泌体提取技术领域，本发明通过包埋组织样本，采用冰冻切片机将组织样本切片，收集样本切片后、酶解、超离、排阻和超滤等步骤，使提取的外泌体产量明显高于现有技术的其他组织外泌体提取方法，相同用量的组织样品，外泌体的得率提高约2~10倍，极大的减少了组织的用量，可以解决各种稀缺组织样本较难获取足够外泌体的问题，0.1~0.2g组织即可满足后续NTA、WB、电镜和转录组等检测分析，实用性好，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及组织切片制备与外泌体提取技术领域，具体涉及一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法。

背景技术

外泌体是由不同细胞释放的30~150nm大小的脂质双层膜包被的颗粒。它们可以包裹和传递RNA、DNA、蛋白质等分子，作为细胞间通信的信使参与多种生理和病理途径。目前从血液、尿液和唾液等体液中分离外泌体的方法已经非常成熟，但是有效的从各种组织细胞间隙中分离到外泌体的相关研究和方法还比较有限。组织外泌体富集过程中的关键环节机械剪切获得细胞悬液的过程，会一定程度造成细胞结构的破坏，破裂的细胞释放大量的脂质体、蛋白复合体等内含物，以及DNA，RNA，细胞器或细胞碎片等，与体液相比极大的增加了外泌体分离纯化难度。

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一种方法，被广泛应用于临床快速病理诊断以及对于疾病的科学研究上。冰冻切片一般使用水、OCT和普通胶水等作为包埋剂，极大缩短了制片时间；同时冰冻切片机械力切割更稳定，不同操作者实验可重复性高，对不同样本处理程度一致性较高，易控制；且切片可一直保持冷冻状态，在冰冻条件下快速切片，切片平整，厚度均一，能比较完好的保存细胞，避免组织细胞损伤、外泌体的降解等，更利于细胞间隙的EVs释放。冰冻切片的优点可以在很大程度上弥补提取组织外泌体时械剪切方法造成的组织样本厚度不均、大小不一、组织样本融化、细胞结构破损等缺点，减少组织细胞的破碎，且使得酶解时间更短，反应更彻底。现有的提取组织外泌体的方法一般都是通过剪切、酶解、离心、超离、超滤等步骤，例如中国专利CN107523536A公开了一种组织来源外泌体的提取方法及应用，核心基于机械剪切、酶裂解组织后使用PEG过夜沉降、离心等步骤提取组织外泌体，耗时较长，而且提取的外泌体中可能存在大量蛋白杂质；中国专利CN111621471A公开了一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用，通过剪切、离心、超滤等步骤提取软组织外泌体，同样是过程繁琐且耗时较长；中国专利2020115224931.3公开了一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，通过酶解、差速离心、超离、分子排阻、超滤的方法实现了组织外泌体的快速提取。现有的专利和文献多对组织外泌体提取的酶解、离心、超滤等方法进行优化以提高组织外泌体提取的纯度和产量，但少有方法对组织外泌体提取的剪切方法进行优化，使得组织外泌体既实现快速提取又实现提取产量的增加。

因此，现有组织外泌体提取技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法，旨在简化操作流程的同时，减少组织样本用量，以进一步提高提取组织外泌体的产量。

为了实现本发明目的，本发明提供一种提高组织外泌体产量的方法，其为使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片，收集组织样品切片提取外泌体。

所述使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片包括以下步骤：

（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；

（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；

（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，直到包埋样品切完。

本发明方法中所述的包埋剂为磷酸盐缓冲溶液（PBS）。