[发明专利]一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法

权利要求书

1.一种提高组织外泌体产量的方法，其特征在于，使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片，收集组织样品切片提取外泌体；

所述使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片包括以下步骤：

（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；所述包埋剂为磷酸盐缓冲溶液PBS；

（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，在样品托盘上浅涂一层PBS，厚度为1~4 mm，将包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；

（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，组织样品切片的厚度为100~300 µm；直到包埋样品切完。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，冰冻切片机开机预冷2~4 h，设置切片机和样品头温度为-15~-30℃，组织样本、包埋盒和样品托盘在干冰中预冷20~40min，包埋剂在1~8℃预冷不低于2 h。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷10~30 min。

4.一种获取组织外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；所述包埋剂为磷酸盐缓冲溶液PBS；

（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；

（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，直到包埋样品切完；

（4）收集组织样品切片，进行酶解、差速离心、超离、排阻和超滤，完成组织外泌体的富集纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，酶解温度37℃，酶解时间为10~20min；

所述差速离心为：1~8℃条件下： 300~600g 10min；2000~3000g 10min；10000~12000g10min；

所述超离为：1~8℃条件下，100000~150000g 2 h；

所述超滤为： 1~8℃条件下， 3000~5000g 1~5min。