[发明专利]一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，包括以下步骤：1)、2)和3)。该用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，以NtTOGT基因序列作为靶序列构建了CRISPR载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的NtTOGT基因靶标序列成功导入烟草品种岩烟97中，得到了NtTOGT基因编辑突变体材料，将该转基因烟草于温室中，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对编辑率较高的株系进行接菌试验，通过接菌实验结果，表明经过基因编辑的烟草可以导致NtTOGT基因的表达量下调，进而影响烟草植株抗青枯病的能力，导致植株抗病性降低，说明NtTOGT基因可能与烟草抗青枯病相关。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法。

背景技术

基因敲除的原理是利用DNA修复DSBs过程中产生的错误，诱导NHEJ途径进行修复，使基因不能正常表达，从而达到阻断或者破坏某个基因的功能的效果，基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)，类转录激活因子核酸酶(TALEN)，规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)三类，CRISPR-Cas系统工作原理简单，成为当今使用最广的基因编辑工具，CRISPR-Cas9可在多种植物中成功进行基因组定点编辑，包括小麦、番茄、大豆等，高通量基因组编辑技术最早应用在动物细胞中，且现在已成为基因筛选广泛应用的方法。

scopoletin glucosyltransferase(NtTOGT)编码东莨菪内酯葡糖基转移酶，催化东莨菪内酯转化为东莨菪苷，并在植物抗病原菌过程中发挥着重要的生物学作用，例如在烟草对烟草花叶病毒(TMV)的过敏反应(HR)中，东莨菪素糖基转移酶大量积累，主要以其葡萄糖基化的东莨菪苷的形式积累，东莨菪素及其糖苷物质的积累，加速了HR反应，进一步加快了病害的发展，所以认为该基因可能影响植物与病原菌互作。

普通烟草是世界范围内广泛种植的一种重要的经济作物，随着种植环境的改变，在耕作的规模化和连做等因素的综合影响下，使得烟草种植的病虫害逐年增多，烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的一种细菌性的土传病害，在世界范围内对烟草、番茄、辣椒等茄科作物以及包括花生、香蕉在内的54科中的接近450种植物产量造成严重危害，青枯病属于典型的维管束病害，植物的根、茎、叶组织均可受害造成植物枯萎，但叶片枯萎后仍呈绿色，故称为“青枯病”，寄主植物发病时，顶部叶片首先萎蔫下垂，然后植株下部叶片开始萎蔫，中部叶片最后萎蔫，或是整株叶片同时萎蔫，从而影响烟草叶片的品质和产量，青枯病在我国的南部烟区的危害较为严重，但近年来，该病害在我国呈现出渐进式北移趋向，对我国烟草产量的影响越来越严重，因此急需探索出烟草青枯病的抗性机制，故而提出了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法来解决上述所提出的问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，具备利于烟草青枯病防治的优点，解决了目前不了解烟草青枯病的抗性机制，影响烟草青枯病防治的问题。

(二)技术方案

为实现上述利于烟草青枯病防治的目的，本发明提供如下技术方案：一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，包括以下步骤：

1)基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体，具体构建方法如下：

①利用CRISPR-P2.0软件对NtTOGT基因设计及筛选特异的sgRNA序列；

②对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；