[发明专利]一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法

权利要求书

1.一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体，具体构建方法如下：

①利用CRISPR-P2.0软件对NtTOGT基因设计及筛选特异的sgRNA序列；

②对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；

③将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；

④将合成后的引物用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体。

2)载体通过使用农杆菌介导的遗传转化方法导入植物宿主细胞，具体应用步骤如下：

①将岩烟97种子消毒处理后分别播种于1/2MS固体培养基中；

②7-10天后代长出小苗单独移栽至分装的1/2MS培养基中光照培养；

③待烟苗长至5-6片真叶左右，选取长势相近的同一批烟苗，在无菌环境中，取烟草叶片切成0.5×0.5cm的小片接种于用液体MS培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5-8min，转移至无菌滤纸吸干残留菌液并吹10min使表面稍微干燥，将烟草叶片分散布于共培养培养基上，使每片叶片均能接触到培养基，在21℃下共培养48h；

④将烟草无菌苗叶片接种到选择培养基上，每30天继代培养1次直到获得基因编辑幼苗，然后将获得的未生根的基因编辑植株转移至生根培养基上诱导生根，直到得到完整的基因编辑植株。

3)快速检测烟草基因编辑转化植株的编辑情况，具体操作步骤如下：

①对基因编辑后代进行阳性鉴定：

设计如下引物序列：

Cas9-F:5’-gctgggccgtgatcaccgacg-3’；

Cas9-R:5’-gaagaggataagaagcacgagc-3’；

PCR反应体系(20uL)：

16uL的双蒸水；2uL的10×EasyTaq Buffer；0.4uL的dNTP；0.2uL的Forward Primer；0.2uL的Reverse Primer；0.2uL的EasyTaq；1uL的DNA样品；

②设计10条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况；

③通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；

④确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；

⑤针对烟草抗病性状通过抗病鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系；

⑥对基因编辑烟草做抗病鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述表达载体包含有SEQ ID NO：2的靶标序列，所述1/2MS培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L、蔗糖15g/L，附加7g/L的琼脂，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。

3.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述MS液体培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L和蔗糖15g/L，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。

4.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述共培养培养基由大量元素50ml/L、微量元素10ml/L、铁盐10ml/L、肌醇10ml/L、NH4NO3 10ml/L、甘氨酸1ml/L、B5维生素1ml/L、1g/L的NAA 20μL/L、1g/L6-BA1ml/L和蔗糖30g/L，调pH至5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。