[发明专利]一种提高红掌转化效率的方法

权利要求书

1.一种提高红掌转化效率的方法，包括通过菌液将外源基因导入红掌的受体材料的过程，其特征在于：

包括如下步骤：受体材料准备；菌液制备；外植体浸染；外植体共培养；转化外植体洗菌；阳性筛选及荧光检测；

所述受体材料来自于带腋芽茎段；

所述菌液按照如下方法制备得到：用带GFP基因的植物表达载体pBI 121，通过酶切连接菊花Flavanone 3-hydroxylase基因，然后使用冻融法导入农杆菌，获得带植物表达载体pBI 121-GFP-Flavanone 3-hydroxylase的农杆菌菌液；

吸取菌液，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值为0. 8，然后离心10min收集菌体，再用 LB液体培养基重悬，振荡培养，至菌液OD值为0.8-1.0，得到遗传转化浸染液，所述LB液体培养基含80-120mg/L 的AS；所述LB液体培养基包括如下组份：8-12g/L胰蛋白胨，4-6g/L酵母提取物，4-6g/L NaCl，pH值为7.2-7.8；

所述外植体浸染为将预培养一周的受体材料浸入到遗传转化浸染液中，让外植体完全浸泡在浸染液中，密封在抽真空的条件下进行浸染，真空度不低于0.08Mpa；

转化外植体洗菌包括将外植体取出，放入灭菌的锥形瓶进行洗菌，将外植体冲洗之后，再利用羧苄青霉素和头孢霉素复合溶液进行多次冲洗，所述羧苄青霉素和头孢霉素的浓度按照冲洗的前后顺序逐步降低，并且降低至与阳性筛选所用培养基一致的浓度；

冲洗过程如下：第一次，无菌水冲洗受体材料表面，直至受体材料表面无附着菌体；第二次，使用含有350-450mg/L 羧苄青霉素，350-400mg/L 头孢霉素无菌水冲洗受体材料表面；第三次，使用含有250-350mg/L 羧苄青霉素，250-350mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗受体材料表面；第四次，使用150-250mg/L 羧苄青霉素，150-250mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗受体材料表面；第五次，使用50-100mg/L 羧苄青霉素，50-100mg/L 头孢霉素无菌水冲洗受体材料表面；第一次冲洗2min，第二次冲洗5min，第三次冲洗10min，第四次冲洗15min，第五次冲洗20min。

2.根据权利要求1所述的一种提高红掌转化效率的方法，其特征在于：所述受体材料按照如下方法得到：选择20-25d的无菌红掌幼苗，切取带腋芽茎段预培养为受体材料；所述预培养的时间不少于2天。

3.根据权利要求1所述的一种提高红掌转化效率的方法，其特征在于：将浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，使用无菌滤纸吸干外植体表面农杆菌，风机吹至表面 无明显菌液，然后转移到含80-120mg/L的 AS的1/2 MS培养基进行共培养，在黑暗条件下共培养不少于3d；所述1/2 MS培养基还包括0.8-1.2mg/L的 6-BA，0.8-1.2mg/L的 ZT，0.2-0.4 mg/L的 IBA，15-25g/L的蔗糖，5-6g/L琼脂，pH 5. 2-5. 4。

4.根据权利要求1所述的一种提高红掌转化效率的方法，其特征在于：阳性筛选包括将洗菌后的外植体，先转移到浓度为50-100mg/L卡那霉素、50-100mg/L头孢霉素和50-100mg/L羧苄青霉素的固体分化诱导培养基中培养，在23-27°C、光周期为10-12h/d的条件下培养不少于10d；然后转接至浓度为50mg/L卡那霉素、50mg/L头孢霉素和50mg/L羧苄青霉素的固体分化诱导培养基中培养，在23-27°C、光周期为10-12h/d的条件下培养不少于15d；接着转接至浓度为50mg/L卡那霉素、50mg/L头孢霉素和50mg/L羧苄青霉素的固体分化诱导培养基中培养，在23-27°C、光周期为10h/d的条件下继续培养；所述固体分化诱导培养基为1/2 MS培养基，还包括1. 0mg/L的 6-BA，1. 0mg/L的 ZT，0. 3 mg/L的 IBA，20g/L的蔗糖，5. 5g/L的琼脂，pH 5. 2 - 5. 4；荧光检测包括在激发光450-490nm蓝光波长照射下，阳性受体材料可激发出绿色荧光，使用体式荧光显微镜对受体材料进行检测，初步筛选阳性植物。