[发明专利]催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了催化活性提高的黄酮3β‑羟化酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对水飞蓟来源的黄酮3β‑羟化酶进行突变，并筛选获得了使圣草酚产量提高的黄酮3β‑羟化酶突变体。将黄酮3β‑羟化酶突变体应用于圣草酚的生产中，可使得圣草酚的产量在摇瓶水平由出发菌株的805.6mg/L，分别提高到1017.8mg/L和1046.5mg/L，分别较原始黄酮3β‑羟化酶的产量提高26.3％和29.9％。

技术领域

本发明涉及催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

圣草酚(Eriodictyol)是一种重要的黄酮类化合物，对人体具有多种益处，如抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，广泛应用于食品添加剂。同时也是多种高附加值化合物的前体，如黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等。圣草酚主要来自于植物提取法，然而植物提取法有许多缺点，如需要高温、提取时间长、需要大量有机试剂等。而使用微生物法生产黄酮类化合物具有较高的潜力。

柚皮素(Naringenin)经过F3′H催化，可以在柚皮素3′引入羟基，从而获得圣草酚。由于F3′H属于P450酶(Cytochrome P450)，因此需要辅酶CPR辅助获得电子才具有催化功能，因此F3′H需要与CPR共表达才具有较好的催化功能。但是只有较少的F3′H及其辅酶CPR的催化功能被很好的验证，此外，由于F3′H/CPR需要锚定在内质网上才可以高效传递电子(图1)，因此大部分的F3′H/CPR在原核微生物中表达活性很低甚至没有活性。由于缺乏高效的F3′H/CPR，对F3′H/CPR表达模式的研究也较少，无法进一步对F3′H/CPR的表达强度进一步提高，目前已报道的使用F3′H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L(Amor,I.L.,et al.,Biotransformation of naringenin to eriodictyol by Saccharomycescerevisiea functionally expressing flavonoid3'hydroxylase.Nat Prod Commun,2010.5(12):p.1893–1898.)。在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L(Zhu,S.,etal.,Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichiacoli.Appl Environ Microbiol,2014.80(10):p.3072–3080.)。

目前利用微生物法生产圣草酚的转化效率和产量都很低，限制了其在实际生产中的应用。

发明内容

本发明中出发基因为来源于水飞蓟的黄酮3β-羟化酶SmF3′H，因为SmF3′H的结构未知，通过理性改造进一步提高SmF3′H的酶活比较困难，为进一步提高圣草酚的合成，可以利用定向进化技术获得酶活提高的SmF3′H突变子，以及相应的高产圣草酚菌株，这对实现工业化微生物法生产圣草酚具有十分重要的意义。

本发明的第一个目的是提供黄酮3β-羟化酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，分别将亲本第344位，或第285位的氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第344位氨基酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第285位氨基酸突变为天冬酰胺，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。