[发明专利]一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌

说明书

本发明公开了一种L‑薄荷醇产量提高的重组酵母菌，属于代谢工程技术领域。本发明以酵母菌为出发菌株，采用诱导型启动子表达基因ERG20WW或/和NPPS，重构MVA代谢合成途径，使得化合物IPP与DMAPP更趋向于合成化合物GPP与NPP，进而更利于L‑薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因L3H，提高L3H酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，或通过蛋白酶融合表达tLIS与L3H基因，克服因L3H酶活过低而导致L‑薄荷醇发酵产量低的因素。采用YPD液体培养基发酵4d，发酵至对数生长期后期添加10％的半乳糖水溶液诱导EEG20WW、NPPS基因与L‑薄荷醇代谢途径基因的表达，保证了细胞的正常生长繁殖，L‑薄荷醇的发酵产量最高达到30.14mg/L。

技术领域

本发明涉及一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，属于代谢工程技术领域。

背景技术

L-薄荷醇(L-menthol)是具有高挥发性单环单萜物质，白色针状结晶，易溶于石油醚、氯仿等有机溶剂，微溶于水。L-薄荷醇是世界范围内销量最大的香料之一，全球年需求量超过2万吨。L-薄荷醇因为具有清凉、杀菌、止痒、镇痛等作用，被广泛的应用于食品、日化、医药、烟草等领域；且还可以作为前体物质合成其他香味物质。目前L-薄荷醇的工业化生产方式较为单一，主要为天然提取与化学合成，天然提取方法需要大量的薄荷属植物原料，化学合成L-薄荷醇同样需要植物来源的百里酚等化合物为底物进行反应拆分。但植物原料生长周期长，市场反馈慢，且容易受到气候、地域等自然环境因素的影响出现产量不稳定。另有以长叶薄荷酮等为底物进行全细胞或酶催化制备L-薄荷醇的方法，仍无法解决植物原料的限制因素。

申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌WMT4，首次实现了发酵法生产L-薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，L-薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/L，但是仍然存在L-薄荷醇发酵产量低的缺点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，采用诱导型启动子表达基因ERG20WW与NPPS，重构MVA代谢合成途径，使得化合物IPP与DMAPP更趋向于合成化合物GPP与NPP，进而更利于L-薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因L3H，提高L3H酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，通过蛋白酶融合表达tLIS与L3H基因，克服因L3H酶活过低而导致L-薄荷醇发酵产量低的因素。

本发明的第一个目的是提供一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，所述的重组酵母菌是以产L-薄荷醇的基因工程菌为出发菌株，表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS，所述的产L-薄荷醇的基因工程菌是以酵母菌为宿主，过表达内源MVA合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因LIS、柠檬烯羟基化酶基因L3H、细胞色素P450还原酶基因CPR、反式异胡椒醇脱氢酶基因IPDH、异薄荷二烯酮还原酶基因IPR、类固醇异构酶基因KSI、长叶薄荷酮还原酶基因PGR和薄荷醇还原酶基因MMR。

进一步地，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的NCBI编号是NP_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的NCBI编号是NP_013636.1，柠檬烯合成酶的NCBI编号是AAC37366.1，柠檬烯羟基化酶的NCBI编号是AAD44151.1，细胞色素P450还原酶的NCBI编号是ABB88839.2，反式异胡椒醇脱氢酶的NCBI编号是AAU20370.1，异薄荷二烯酮还原酶的NCBI编号是AAQ75422.1，类固醇异构酶的NCBI编号是AFY18860.1，长叶薄荷酮还原酶的NCBI编号是AAQ75423.1，薄荷醇还原酶的NCBI编号是AAQ55960.1。

进一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的橙花二磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。