[发明专利]提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法

说明书

本发明公开了提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法，属于生物工程领域。本发明提供了发酵培养基配方，发酵培养基富含谷氨酸棒杆菌CG‑ECT3生长所需的碳源、氮源、无机盐及复合微量元素，使菌种快速生长繁殖培养13小时，OD₆₀₀可达40以上，增加质粒拷贝数，缩短迟滞期和对数生长期时间。同时，本发明通过在发酵过程中控制发酵液残糖及前体物质—L‑天门冬氨酸补加，使重组谷氨酸棒杆菌CG‑ECT3的产酸能力得到提高，缩短发酵周期，发酵45h Ectoines产量可达48g/L以上。

技术领域

本发明涉及提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法，属于生物工程领域。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoines)是一种环状氨基酸衍生物，是一些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一种渗透压补偿溶质，不仅可为细胞生长提供能源物质，还能对逆境下的核酸、蛋白质及其细胞具有稳定性作用。在环境修复保护剂，酶、蛋白质和核酸等生物大分子的保护剂，细胞保护剂，化妆品添加剂及药物制剂等领域都具有广泛的应用价值和应用前景。

目前，Ectoines由微生物发酵主要有两种思路：

第一种，利用嗜盐微生物通过高盐诱导合成、低盐释放的“细胞挤奶法”来达到Ectoines的胞内积累和分泌。

第二种，利用代谢工程、基因工程技术构建重组菌株在低盐条件下控制发酵条件获得Ectoines。

第一种方法因其高盐浓度的培养基对设备要求高，工艺流程复杂，下游纯化难度大，生产成本昂贵等因素已有被第二种方法取代的趋势。CN110699310A公开了一株高产Ectoines的谷氨酸棒杆菌，避免了高盐培养基带来的一些弊端，同时规避了大肠杆菌带来的安全问题，为Ectoines的工业化生产提供重要实践意义。但是，一方面，由于该方案所用培养基涉及存在TSE风险的成份，例如：脑心浸出液，制约了其在化妆品及医药方面的应用；另一方面，谷氨酸棒杆菌作为一种成熟的氨基酸产品工业微生物生产菌株，其代谢过程中会产生缬氨酸、亮氨酸等氨基酸及中间代谢产物。因此，有必要通过安全廉价的培养基，开发一种发酵过程控制方法，减少杂酸、中间代谢产物产生来实现提高重组谷氨酸棒杆菌Ectoines产量的目标。

发明内容

[技术问题]

现有的用于培养谷氨酸棒杆菌工程菌生产四氢嘧啶的培养基存在TES风险，且谷氨酸棒杆菌发酵过程的中间代谢物、杂酸多，会影响谷氨酸棒杆菌Ectoines产量。

[技术方案]

本发明提供了用于谷氨酸棒杆菌发酵产四氢嘧啶的培养基：

一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0-5.0，酵母粉1.5-2.5，氯化钠5.0-6.0，磷酸氢二钠2.0-2.5，葡萄糖5.0-6.5，玉米浆0.1-0.2；用液氨调节pH 7.0±0.3。可选的，一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0，酵母粉2.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钠2.5，葡萄糖5.0，玉米浆0.1。用液氨调节pH7.0±0.3。