[发明专利]提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法

权利要求书

1.一种培养重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，所述重组谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，并且，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya，磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya；所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的27～2294bp所示，表达耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒；编码第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示；所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示；

其特征在于，

包括步骤：

(1)培养获得一级种；

将重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3菌种按0.5-0.6％的接种量接种于一级种子培养基中进行扩培，装液量：40-45％；温度：30.0±2℃；摇床频次：120-150rpm；培养时间：12-14h，获得一级种；一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0-5.0，酵母粉1.5-2.5，氯化钠5.0-6.0，磷酸氢二钠2.0-2.5，葡萄糖5.0-6.5，玉米浆0.1-0.2；用液氨调节pH 7.0±0.3

(2)培养获得二级种；

(3)发酵产四氢嘧啶，在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量并补加前体物质—L-天门冬氨酸；

在发酵过程，当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、pH有反弹趋势时，进行第三次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖不超过5g/L，如此反复多次补加葡萄糖，当Ectoines的生产速率＜0.25g/L·h时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵；

发酵培养基以g/L计，含：葡萄糖20-25，(NH₄)₂SO₄ 15-20，KH₂PO₄ 0.8-1.0，K₂HPO₄0.8-1.0，MgSO₄ 0.25-0.5，生物素0.2×10^-3，玉米浆12.5-15或玉米粉5.0-7.5，KCl 1.9-2.3，L-门冬氨酸2.5-3.5，复合微量元素1-2mL；用液氨调节pH 7.0±0.3；所述复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L；

当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％时，一次性补加L-天门冬氨酸2g/L。