[发明专利]一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法

权利要求书

1.一种非治疗目的的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液中还添加咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为30-50μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.4-0.6％；

(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM获能液重悬，调整精液浓度4×10⁶个/mL-9×10⁶个/mL，放入培养箱中获能35-45min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.4-0.9份，氯化钾0.01-0.05份，二水氯化钙0.08-0.12份，葡萄糖0.1-0.2份，丙酮酸钠0.02-0.08份，咖啡因0.005-0.010份，L-半胱氨酸0.002-0.008份，Tris0.1-0.3份，牛血清白蛋白0.05-0.20份溶于90-110份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液；

(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存；

(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成。

2.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，所述受精操作液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠6-7份，氯化钾0.1-0.3份，碳酸氢钠0.1-0.3份，磷酸二氢钠0.01-0.06份，乳酸钠1-2份，六水氯化镁0.1-0.2份，羟乙基哌秦乙硫磺酸1-4份，酚红0.005-0.015份，二水氯化钙0.1-0.3g，聚乙烯醇0.05-0.15份，山梨醇1-3份，丙酮酸钠0.01-0.03份，青霉素钠0.04-0.08份，硫酸链霉素0.04-0.06份溶于900-1100份三蒸水中，滤器过滤后，制得受精操作液。

3.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，将卵丘-卵母细胞复合体培养出卵母细胞的具体操作为：将卵丘-卵母细胞复合体，在平衡好的成熟液Ⅰ中洗两遍，最后放入矿物油覆盖的成熟液Ⅰ小滴中，每个小滴30枚卵母细胞，然后放入38.5℃、体积浓度为5％CO₂的完全湿度培养箱中培养22h，后换入提前2h制作和平衡好的成熟液Ⅱ小滴中于培养箱中培养22h；

所述成熟液Ⅰ的成分如下：mTCM 3.82mL，卵泡液500μL，胎牛血清500μL，L-半胱氨酸5μL，孕马血清促性腺激素50μL，人绒毛膜促性腺激素25μL，双抗100μL；

所述成熟液Ⅱ成分如下：mTCM 3.895mL，卵泡液500μL，FBS 500μL，L-半胱氨酸5μL，双抗100μL；

所述mTCM是将葡萄糖0.05495g和聚乙烯醇0.10098g溶于100mL M199培养基中制成。

4.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，mTBM受精小滴采用以下方法制成：将mTBM获能液在培养皿中做成小滴，每滴上面覆盖100μL矿物油，于38.5℃、CO₂体积分数为5％的完全湿度培养箱中平衡2h后，制得mTBM受精小滴。

5.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，胚胎培养液采用以下方法制成：将氯化钠0.6318g，氯化钾0.075g，硫酸镁0.0049g，磷酸二氢钾0.005g，亚牛磺酸0.055g，碳酸氢钠0.211g，L-谷氨酰胺0.015g，丙酮酸钠0.0023g，乳酸钙五水合物0.06166g，BSA 0.3g，BME培养基2mL，MEM培养基1mL，青霉素钠0.065g，硫酸链霉素0.05g依次加入至三蒸水中，混合搅拌均匀后，继续添加三蒸水定容至100mL，制得胚胎培养液。