[发明专利]一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法

说明书

本发明公开了一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理；(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，重悬后培养得到获能精液；(3)将抽出卵泡液的卵巢在显微镜下拣出卵丘‑卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘；(4)向每个受精小滴加获能精液，放入培养箱中培养后洗去卵母细胞上附着的精子，体外受精培养完成。本发明通过在冷冻基础液Ⅰ联合添加相应浓度的咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，两者产生的协同作用，能有效的提高解冻后猪精子的活力、质膜完整率、DNA完整率，进而提高解冻后猪精子体外受精效果。

技术领域

本发明涉及猪精子冷冻保存技术领域，具体涉及一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法。

背景技术

精液的冷冻保存可以有效保留生物的遗传育种和种质资源[8]。随着猪冷冻精液生产工艺和人工授精技术的迅速发展，采用冷冻精液繁育的种猪在受孕率和仔猪分娩数方面均得到了有效的提高，已经接近鲜精的配种水平。但猪冷冻精液生产因难度大、冻精-解冻后活率及受胎率低等诸多原因，导致猪精液冷冻技术的研究仍未完全成熟。总体而言，完善猪冷冻精液制备技术，还有很多的问题亟待解决。

猪是一种在转基因生物反应器领域有着广阔应用前景的模型动物,需要建立一套有效的体外繁殖技术为转基因猪生产提供大量高质量的成熟卵母细胞和胚胎。体外成熟(IVM)猪卵母细胞IVF后囊胚发育率在20％左右，与牛、羊等动物体外胚胎生产(IVP)相比,猪IVP的效率较低。卵母细胞成熟质量差、多精子受精率高和胚胎质量差是猪IVP所面临的主要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法，包括以下操作步骤：

(1)将冷冻后的精液取出后解冻处理，其中精液冷冻所用的冷冻基础液由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液中还添加咖啡酸苯乙酯和聚乙烯吡咯烷酮，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液中的摩尔浓度为30-50μmol/L，聚乙烯吡咯烷酮在冷冻基础液中的质量分数为0.4-0.6％；

(2)将解冻处理后的精液用受精操作液清洗并离心2次，再将离心沉淀用mTBM获能液清洗离心1次，离心后向沉淀中加入mTBM获能液重悬，调整精液浓度4×106个/mL-9×106个/mL，放入培养箱中获能35-45min，得到获能精液，所述mTBM获能液采用以下方法制成：按重量份计，将氯化钠0.4-0.9份，氯化钾0.01-0.05份，二水氯化钙0.08-0.12份，葡萄糖0.1-0.2份，丙酮酸钠0.02-0.08份，咖啡因0.005-0.010份，L-半胱氨酸0.002-0.008份，Tris0.1-0.3份，牛血清白蛋白0.05-0.20份溶于90-110份三蒸水中，滤器过滤后，制得mTBM获能液；

(3)将刚从母猪体内取下来的卵巢于半小时内抽出卵泡液，在显微镜下拣出卵丘-卵母细胞复合体，培养后取出卵母细胞，脱去卵丘，放入受精操作液中洗一遍，在显微镜下拣出有极体的成熟卵母细胞，mTBM获能液中洗一遍，将成熟卵母细胞放入平衡好的mTBM受精小滴中备用保存；

(4)向每个受精小滴加步骤(2)制得的获能精液，放入培养箱中培养5-7h后在胚胎培养液中洗去卵母细胞上附着的精子，然后再放入胚胎培养液中进行培养，体外受精培养完成。