[发明专利]一种提高转导效率的慢病毒载体及其应用

说明书

本发明提供一种提高转导效率的慢病毒载体及其应用，慢病毒载体是以HIV‑1为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因导入动物和人的多种原代细胞或细胞系中，具有广阔的应用前景。本发明建立了使用VSVG突变体从而不受MARCH8影响的慢病毒载体系统，提高了利用正常293T细胞制备的慢病毒的转导效率。同时，本申请建立了MARCH8缺失的293T细胞，利用此缺失MARCH8的293T细胞进行慢病毒的制备，提高了产生慢病毒的转导效率，进一步优化了慢病毒载体系统。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种VSVG突变体及其不受MARCH8影响的慢病毒载体系统，以及其制备与应用。

背景技术

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体可以将外源基因（或shRNA等）导入动物和人的原代细胞或细胞系中，有效整合到宿主染色体上，进而可以持久表达。同时，慢病毒载体具有广阔的宿主范围，可以感染多种类型细胞，如淋巴细胞、肝细胞、神经元细胞等，能够达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。慢病毒载体介导的基因表达或RNA干扰作用持续且稳定，主要原因是目的基因整合到宿主的基因组中，随细胞基因组的分裂而分裂，而且慢病毒能有效感染非分裂细胞。文献报道表明，慢病毒载体介导的目的基因可持续表达于多种组织或细胞中，如脑、肝脏、视网膜、干细胞等。

慢病毒表达载体包含了包装、稳定整合所需的遗传信息。为产生高滴度的病毒颗粒，常利用表达载体和包装质粒共转染293T细胞，在293T细胞中进行病毒的包装，成熟的慢病毒颗粒被分泌到培养基中，离心所得上清可以直接感染靶细胞，慢病毒携带目的基因在靶细胞中通过反转录整合到基因组，进而持续表达。现今常用的慢病毒包装系统主要使用VSVG蛋白（水疱性口炎病毒G蛋白）替代Env包膜蛋白，扩大了病毒载体的靶细胞范围，而且增加了载体的稳定性，可以通过高速离心浓缩病毒载体，从而提高滴度，VSVG包膜蛋白在慢病毒载体构建及使用中发挥着不可替代的作用。

VSV具有广泛的宿主范围，可以感染多种细胞，表明它可以通过某种普遍存在的受体进入宿主细胞。研究发现，低密度脂蛋白受体LDLR可以作为VSV、VSVG包装的假病毒的进入所需受体，普遍存在的LDLR家族成员为VSV、VSVG包装的假病毒的广泛应用提供可能。据此，在制备慢病毒的293T细胞中缺陷LDLR蛋白，可以减少产生的慢病毒再次进入细胞，从而提高慢病毒的产量。

近几年，在HIV-1与宿主限制因子的相互作用研究中发现E3泛素连接酶MARCH8可以抑制HIV-1的复制，通过减少病毒颗粒中包膜糖蛋白的插入，降低病毒颗粒的感染性。研究同时发现，MARCH8可以导致VSVG降解，从而降低VSVG在细胞中的表达。MARCH8属于一类膜结合的E3泛素连接酶MARCHs蛋白家族，MARCHs蛋白N端胞内区均含有一个C4HC3 RING-finger结构域。MARCHs蛋白的发现最早源于对病毒免疫逃逸机制的研究，病毒来源的MARCHs蛋白的主要功能是下调细胞表面主要组织相容性复合物（Majorhistocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子表达，帮助病毒实现免疫逃逸。目前已知胞内MARCHs蛋白共有十一个成员，其中，除了MARCH7和MARCH10没有预测的跨膜结构域（Transmembrane domain, TM）外，其它MARCHs家族成员均有两个或以上的跨膜区。含有两个跨膜区的MARCHs蛋白共有七个，分别是MARCH1, 2, 3, 4, 8, 9和11，根据氨基酸序列相似性，将这七个蛋白分为三个亚家族，分别是：MARCH1和8，MARCH2和3，MARCH4, 9和11。对于MARCHs的功能研究集中于通过泛素化调节胞内蛋白的降解和运输。已经发现，MARCH1和MARCH8能够下调MHCⅠ，MHCⅡ，CD86和白介素1受体辅助蛋白（IL-1 Receptor AccessoryProtein，IL1RAP）等多种细胞膜蛋白的表达，是一种重要的免疫调节蛋白。