[发明专利]一种提高去甲四环素产量的方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高去甲四环素产量的方法，包括以下步骤：(1)斜面培养，(2)诱变处理；(3)抗性筛选；(4)菌株初筛；(5)菌株复试；(6)再对步骤(5)筛选得到的菌株进行发酵工艺优化，进一步提高去甲四环素的发酵水平。本发明通过菌种选育和工艺优化，能够使用去甲金霉素生产菌株生产去甲四环素，并且达到了工业化生产水平，为简化米诺环素、替加环素等高附加值产品的合成步骤，降低生产成本，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高去甲四环素产量的方法。

背景技术

四环素类抗生素(Tetracyclines)是一类具有并四苯(Naphthacene)核心结构的广谱抗生素，包括土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四环素(DMTC)、强力霉素、米诺环素、替加环素等(Nguyen F,Starosta AL,Arenz S,Sohmen D,Donhofer A,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistancemechanisms.Biological chemistry 395(5):559-75)。在这些抗生素中，OTC、CTC、TC、DMCTC和DMTC是天然产物，OTC由Streptomyces rimosus产生，CTC、TC、DMCTC和DMTC由Streptomyces aureofaciens或其突变体产生。

在实际生产中，以去甲金霉素为原料合成去甲四环素(图1)，然后以去甲四环素为原料合成米诺环素，米诺环素可以进一步合成价值更高的替加环素。去甲金霉素为原料合成去甲四环素的过程需要经过金属钯(Pd)催化的高压氢化脱氯反应，此反应危险并且成本高，所以，如果能够通过发酵法生产去甲四环素，可以简化米诺环素、替加环素等合成的步骤，减少危险因素，降低生产成本。然而，去甲四环素(DMTC)的研究报道很少。CN201910693880.8通过敲除金霉素生产菌株S.aureofaciens CGMCC4.1043中编码甲基转移酶的ctcK基因，获得产去甲四环素的工程菌株DMT1，并在此基础上通过过表达合成簇内激活基因ctcB、抗性基因ctcR、合成基因ctcQ等策略，进一步提高了去甲四环素的产量；CN201911007748.3通过调整发酵罐培养基组成、调整补料配方，配合发酵过程工艺控制，得到了一种使用金色链霉菌发酵生产去甲四环素的方法。

在去甲金霉素发酵过程中，去甲四环素是其中杂质之一，产量很低。去甲四环素与去甲金霉素的结构差别是7位缺少氯原子，所以推测合成过程是先合成去甲四环素，然后7位卤化加氯，合成去甲金霉素。如果能够通过菌种选育和工艺优化，使发酵主产物由去甲金霉素转为去甲四环素，用于去甲四环素的生产，则具有重要的应用价值。鉴于此，本发明开发了一种通过去甲金霉素生产菌株Streptomyces aureofaciens(金色链霉菌)诱变提高去甲四环素产量的方法。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种提高去甲四环素产量的方法。

本发明采用的具体技术方案，一种提高去甲四环素产量的方法，关键是，包括以下步骤：

(1)斜面培养：将去甲金霉素生产菌株接种斜面培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件下培养10-15天；

(2)诱变处理：斜面培养成熟后将孢子刮下，接种至菌丝培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养4-10h，然后进行常压室温等离子体(ARTP)处理；

(3)抗性筛选：将经ARTP处理的菌悬液进行稀释、分离，稀释液涂布在含有100-1000μg/mL去甲四环素的分离培养基上，25-30℃，20％-60％湿度条件下培养10-15天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；