[发明专利]一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法

说明书

本发明提供一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，包括以下步骤：(1)选取棉花种子，去除种皮；(2)无菌苗培养；(3)愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导；(4)胚性愈伤组织的增殖；(5)基于外源腐胺固液交替培养的胚状体分化调控；(6)生根培养；(7)驯化与移栽。本发明方法中提供的MSB培养基为改良的MSB培养基，由MS无机盐和B₅有机物构成，在固液交替培养过程中促进胚状体分化时添加了1mM腐胺可以显著提高胚状体分化。本发明为提高棉花体细胞胚胎发生效率提供了一种有效的方法，具有一定的社会效益和经济效益，对我国棉花产业发展有重大贡献。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法。

背景技术

我国是棉花种植和消费大国，总产量已居世界之首。棉花是重要的经济作物，其涉及的产业链长，行业从事人员广，棉花的生产关乎到社会经济生活的诸多方面。

棉花的高产优质是育种工作者们不断追求的目标，经过几代人的不懈努力，目前棉花在产量和质量上都有了极大地提高，想进一步发展难度较大；同时由于棉花的生长周期长，整个周期内会遭受各种不良环境，多种病虫草害的影响，对棉花的产量品质等的影响极大。限于棉花的种质资源有限，单纯依靠常规育种很难解决上述问题。

基因工程作为一种改造植物的手段后，使通过遗传转化方法“定向改造”棉花性状成为了可能，更为种质资源的创新开辟了新的途径。目前对棉花开展的相关方面的研究多是以植物组织培养技术的基础通过农杆菌介导的棉花外植体来实现的。

通过体细胞胚胎发生途径再生是棉花组织培养的主要方式，但是棉花是一类难以进行组培的作物，实验的成功与否对试材的基因型依赖极强，培养周期长、培养过程繁琐、胚状体发生效率低等都是这一途径的困难。拓宽可进行组培再生及遗传转化的棉花品种数量以及建立高效的再生体系是顺利开展棉花遗传转化工作的必要前提。

发明内容

本发明目的在于提供一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，为提高棉花体细胞胚胎发生效率提供了一种有效的方法，具有一定的社会效益和经济效益，对我国棉花产业发展有一定的贡献。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，包括下述步骤：

(1)选取棉花种子，去除种皮；

(2)无菌苗培养：将步骤(1)的去除种皮后的棉花种子消毒，并接种至无菌苗培养基，进行无菌苗培养，培养过程为，于接种培养2天后将萌发的胚根插入无菌苗培养基中扶苗，扶苗之后继续培养4天得到无菌苗，此过程均于28℃恒温暗培养；

(3)愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导：取步骤(2)无菌苗培养得到的无菌苗，切掉子叶和胚根，下胚轴切为0.6-0.8cm茎段并接种于愈伤组织诱导培养基，进行愈伤组织诱导和胚性愈伤组织的诱导，此过程，于28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天，每隔30天继代培养一次，直至分化获得胚性愈伤组织；

(4)胚性愈伤组织的增殖：将步骤(3)得到的刚分化的胚性愈伤组织接种至含终浓度0.5mg/LIBA和0.1mg/LKT的固体MSB培养基上，生长得到淡黄色疏松胚性愈伤组织后将其转移至含终浓度1g/LNaCl、0.5mg/LIBA和0.1mg/L KT的液体MSB培养基上，28℃震荡悬浮光照培养5天完成增殖，光照时间为14小时/天；

(5)基于外源腐胺固液交替培养的胚状体分化调控：将步骤(4)的悬浮培养物过筛，将过筛后的培养物进行沉淀，倒弃沉淀后的上清液，于沉淀中再重新加入少量液体MSB培养基重悬，重悬后接种至胚状体分化调控培养基，进行胚状体分化，此过程，于28℃恒温光照培养，培养时间为4周，光照时间为14小时/天；