[发明专利]一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法

权利要求书

1.一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，其特征在于：包括下述步骤：

（1）选取棉花种子，去除种皮；

（2）无菌苗培养：将步骤（1）的去除种皮后的棉花种子消毒，并接种至无菌苗培养基，进行无菌苗培养，培养过程为，于接种培养2天后将萌发的胚根插入无菌苗培养基中扶苗，扶苗之后继续培养4天得到无菌苗，此过程均于28℃恒温暗培养；

（3）愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导：取步骤（2）无菌苗培养得到的无菌苗，切掉子叶和胚根，下胚轴切为0.6-0.8 cm茎段并接种于愈伤组织诱导培养基，进行愈伤组织诱导和胚性愈伤组织的诱导，此过程，于28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天，每隔30天继代培养一次，直至分化获得胚性愈伤组织；

（4）胚性愈伤组织的增殖：将步骤（3）得到的刚分化的胚性愈伤组织接种至含终浓度0.5 mg/L IBA和0.1 mg/L KT的固体MSB培养基上，生长得到淡黄色疏松胚性愈伤组织后将其转移至含终浓度1 g/L NaCl、0.5 mg/L IBA和0.1 mg/L KT的液体MSB培养基上，28℃震荡悬浮光照培养5天完成增殖，光照时间为14小时/天；

（5）基于外源腐胺固液交替培养的胚状体分化调控：将步骤（4）的悬浮培养物过筛，将过筛后的培养物进行沉淀，倒弃沉淀后的上清液，于沉淀中再重新加入少量液体MSB培养基重悬，重悬后接种至胚状体分化调控培养基，进行胚状体分化，此过程，于28℃恒温光照培养，培养时间为4周，光照时间为14小时/天；

（6）生根培养：将步骤（5）培养可见明显子叶的成熟胚状体转移至生根培养基中，于28℃恒温光照培养，进行生根培养，光照时间为14小时/天；

（7）驯化与移栽：将步骤（6）中长出发达根系的植株进行水培炼苗，驯化后移栽至营养土钵中继续生长，此过程，于28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天；

所述步骤（2）中，无菌苗培养基为大量元素减半的MSB培养基；所述步骤（3）中，愈伤组织诱导培养基为含终浓度0.1 mg/L 2, 4-D和0.1 mg/L KT的MSB培养基；所述步骤（5）中，胚状体分化调控培养基为去掉NH₄NO₃，且KNO₃含量加倍，并含终浓度0.5 mg/L IBA、0.1 mg/L KT和1 mM 腐胺的MSB培养基；所述步骤（6）中，生根培养基为1/2MSB培养基，所述1/2MSB培养基为无机物含量减半，有机物含量不变的MSB培养基；

其中，所述MSB培养基为改良的MSB培养基，其成分如下：硝酸钾1.9 g/L、硫酸铵1.65g/L、磷酸二氢钾0.17 g/L、七水硫酸镁 0.37 g/L、二水氯化钙0.44 g/L、四水硫酸锰22.3mg/L 、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸锌8.6 mg/L、碘化钾0.83 mg/L、二水钼酸钠 0.25 mg/L、五水硫酸铜0.025 mg/L、六水氯化钴0.025 mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3 mg/L、七水硫酸亚铁27.8 mg/L、甘氨酸2 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸硫胺素10 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、肌醇100mg/L、葡萄糖30 g/L，pH为5.8~6.0；当使用的培养基为固体培养基时，添加植物凝胶2.5 g/L。

2.根据权利要求1所述的通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，消毒过程为先使用0.1%升汞消毒10分钟，后用无菌水冲洗3-4次。