[发明专利]一种提高膜片钳实验效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高膜片钳实验效率的方法，包括以下步骤：用基质胶包被细胞培养板，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后进行传代培养，将传代培养的细胞接种至基质胶包被的细胞培养板中培养，然后将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。本发明的方法使得上样时细胞平均存活时间增加了200％‑400％，显著地提高了膜片钳实验效率。

技术领域：

本发明属于电生理膜片钳技术领域，具体涉及一种提高膜片钳实验效率的方法。

背景技术：

膜片钳技术是一种记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道分子活动的技术。是用来研究单个离体的活细胞、组织切片或细胞膜片离子流的电生理实验技术。这项技术在可兴奋细胞如神经元、心肌细胞、肌纤维和胰腺细胞的研究中起至关重要的作用，也可用于研究特殊制备的巨型球状体中的细菌离子通道。

传统膜片钳技术对实验人员的技术要求非常高，一般地，实验人员需要经过严格的长期的训练，才能准确且快速的操作。虽然早在2004年，已经发明出了全自动膜片钳，操作简单，易掌握，通量高(是传统膜片钳的数十倍)。但是全自动膜片钳只适用于药物的初筛和二次筛选，且对样本有很高的选择性，而传统的膜片钳技术可适用于各种样本，应用范围广，能够分析检测所有的离子通道类型，同时能够分析离子通道的动力学特征。因此目前，传统膜片钳技术仍然是不可替代的。

在进行膜片钳实验时，玻璃电极尖端给负压并吸住细胞，形成高阻封接，破膜，给药，记录数据的过程，都需要细胞保持最好的活性状态，才能更加高效的获得有效数据。因此细胞的稳定性就成了评估样品好坏的关键。

在传统膜片钳实验中，样品准备是非常关键的步骤，细胞也即样品状态的好坏，直接决定了实验效率。在研究各种离子通道时，实验人员最常使用的工具细胞有HEK293T细胞系。

1973年，最原始的HEK293细胞来源于一个夭折的人类胚胎肾细胞中。将人的胚胎肾细胞中转化入人5型腺病毒DNA片段，得到的细胞即为HEK293细胞。293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株，即为293T细胞系。这使得包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。HEK293T细胞易于转染，且能短时间内快速表达蛋白。

综上所述，传统膜片钳是电生理领域最重要的实验技术，但是因为操作难度极高和实验效率低下的原因，严重影响了传统膜片钳充分发挥其作用。

发明内容：

本发明旨在提供一种提高膜片钳实验效率的方法，从而显著地提高实验效率的目的。该方法可提高2-5倍的实验效率，使获得实验数据更加稳定和高效。

为达到上述目的，本发明采用技术方案为：

一种提高膜片钳实验效率的方法，包括以下步骤：用基质胶包被细胞培养板，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后进行传代培养，将传代培养的细胞接种至基质胶包被的细胞培养板中培养，然后将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

具体步骤如下：将基质胶加入到预冷的无血清的DMEM/F12培养基中，混匀后加入到细胞培养板中孵育，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后接种到含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，将传代培养的细胞接种至添加有含有10％胎牛血清的DMEM培养基的基质胶包被的细胞培养板中培养，待细胞融合密度达到60％-70％时，将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞用胰酶消化，离心收集细胞，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，将重悬后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

进一步地，所述的基质胶与预冷的无血清的DMEM/F12培养基的添加比为1:100～200。

进一步地，所述的细胞为HEK293T细胞。