[发明专利]提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用

说明书

本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，该方法具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理；将上述提高细胞通透性的方法在制备葡萄糖二酸中应用，过程为：发酵培养表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法和化学表面活性剂对细胞进行通透化处理，利用通透化处理过的细胞来生产葡萄糖二酸。使用该方法进行细胞通透性处理，效果显著；将该方法应用于制备葡萄糖二酸中，可为生成葡萄糖二酸的转化过程提供良好的转化环境。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用。

背景技术

葡萄糖二酸被称为“最具价值的生物炼制产品”(Werpy T,Petersen G,Aden A,etal.Top valueadded chemicals from biomass,volume 1:results ofscreening forpotential candidates from sugars andsynthesis gas.Washington,DC:US DepartmentofEnergy,2004)，其作为一种重要的反应中间体，在生产聚合物材料、食品添加剂具有重要的应用价值，随着研究的深入，葡萄糖二酸及其衍生物在降低胆固醇、调控人体内激素水平等方面发挥的作用逐渐受到医学界的重视(仇钰莹,方芳,堵国成,等.葡萄糖二酸研究进展[J].生物工程学报,2015,25(04):38-47.)。

随着人们对“绿色天然健康无公害”食品的不断推崇，国内外以化学氧化和微生物合成方法生产葡萄糖二酸的方法产生逐渐被绿色生产的方法所取代，在绿色生产方法的研究中，利用微生物体外发酵生产葡萄糖二酸成为了发展趋势。采用生物工程技术手段，通过构建重组工程菌，在微生物体内过表达葡萄糖二酸生物合成核心途径中的关键酶基因，利用表达的活性蛋白，催化底物逐步转化为葡萄糖二酸。

但是利用该重组工程菌发酵生产葡萄糖二酸的过程中存在以下2个问题：(1)重组工程菌的葡醛酸脱氢酶虽高效表达，但由于表达的活性蛋白主要存在于胞内，与底物的接触机会受限于细胞膜的通透性，大大降低了该重组工程菌的催化性能；(2)重组工程菌只能使用一次，利用率低下，成本高，污染大。

基于以上现状，需要寻找一种改善细胞通透性的方式，促进底物葡萄糖醛酸向胞内的转运，从而提高葡醛酸脱氢酶酶的利用率，进一步提高葡萄糖二酸的产量。目前国内外还没有关于对生产葡萄糖二酸的重组菌细胞进行通透化处理的报道，因此通过物理、化学方法，提高菌体细胞膜的通透性，促进细胞外营养物质进入细胞内或者细胞内代谢产物分泌到胞外，克服胞内产物的抑制作用，对葡萄糖二酸的生产具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明提供了提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，该提高细胞通透性的方法具体为一种通过物理方法或化学方法对细胞进行处理的方法，使用该方法进行细胞通透性处理，效果显著；将该方法应用于制备葡萄糖二酸中，可为生成葡萄糖二酸的转化过程提供良好的转化环境。

本发明的技术方案如下：

一种提高细胞通透性的方法，具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理；

所述物理法为超声波破碎法或反复冻融法，其中，在超声波破碎法中，超声频率频率25KHz，功率为200W，超声时间为20～100s；在反复冻融法中，反复冻融的时间为15min，次数为1～3次；

所述化学法为添加表面活性剂或添加有机溶剂作为通透剂，然后静置或慢速搅拌悬浮液10～30min；其中，添加表面活性剂时，表面活性剂的浓度为0.1～5g/L。

优选的，在化学法中，所述表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通X-100)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)中的一种。

优选的，在化学法中，所述有机溶剂为甲苯，浓度为0.3％。