[发明专利]提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用

权利要求书

1.一种提高细胞通透性的方法，其特征在于，具体为使用物理法或者化学法对细胞进行处理；

所述物理法为超声波破碎法或反复冻融法，其中，在超声波破碎法中，超声频率频率25KHz，功率为200W，超声时间为20～100s；在反复冻融法中，反复冻融的时间为15min，次数为1～3次；

所述化学法为添加表面活性剂或添加有机溶剂作为通透剂，然后静置或慢速搅拌悬浮液10～30min；其中，添加表面活性剂时，表面活性剂的浓度为0.1～5g/L。

2.如权利要求1所述的提高细胞通透性的方法，其特征在于，在化学法中，所述表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚或十六烷基三甲基溴化铵中的一种。

3.如权利要求1所述的提高细胞通透性的方法，其特征在于，在化学法中，所述有机溶剂为甲苯，浓度为0.3％。

4.如权利要求1-3任一项所述的提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用，其特征在于，过程为：发酵培养表达葡醛酸脱氢酶的细胞，使用物理方法或化学表面活性剂对细胞进行通透化处理，利用通透化处理过的细胞来生产葡萄糖二酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)重组大肠杆菌的构建：将葡醛酸脱氢酶基因插入表达载体中，并导入宿主菌中表达，获得重组大肠杆菌；

(2)收集细胞悬液：活化步骤(1)获得的重组大肠杆菌菌株，接种到LB培养基中，37℃，200rpm条件下振荡培养，至OD₆₀₀为0.6～1.0时，添加IPTG进行诱导并降低温度继续培养6～18h；4℃离心收获菌泥；将菌泥用Tris-Hcl洗涤、MOPS反应液重悬后培养，获得菌泥重悬液；

(3)细胞通透性处理：将步骤(2)中菌泥重悬液进行细胞通透性处理，提高细胞通透性；

(4)添加底物：向步骤(3)中细胞通透化处理过的菌悬液中添加一定浓度的葡萄糖醛酸，继续37℃，200rpm条件下振荡培养10h；

(5)产物的测定：采用超高效液相色谱(HPLC)定量测定发酵产生的葡萄糖二酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，进一步的，在步骤(1)中，所述葡醛酸脱氢酶来源于假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas synxantha strain KENGFT3)和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas fragistrain P121)；所述的表达载体为pETDuet-1；所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌XL1-Blue或大肠杆菌Rosetta。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述诱导剂IPTG的添加量为0.4mM；所述添加IPTG之后重组大肠杆菌的培养温度为26℃、培养时间18h。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述菌泥的添加量为5～10g/L；所述Tris-Hcl洗涤液的pH为7.5，浓度为25mM；所述MOPS的pH为7.5，浓度为100mM。