[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，属于基因工程领域。本发明通过敲除ATP结合蛋白基因oppD、鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD和鞭毛蛋白基因Hag，并结合在特定筛选压力下的适应性进化方法，获得比生长速率提高的菌株，使枯草芽孢杆菌的生长速率提高24.18～75.05％甚至更高，并使核酸含量提高10.31～37.56％甚至更高。本发明的方法可缩短菌株的发酵周期，提高核糖核酸的生产力，并有助于提高市场竞争力。

技术领域

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性细菌的典型代表，它不产生细胞壁内毒素，所生产的产品被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为食品级安全。另外，枯草芽孢杆菌作为一种非致病性微生物，具有生长速度快(20min增殖一代)、培养时间短、培养要求低、遗传背景清晰利于改造、嘌呤合成能力强等优点，因此，在科学研究与工业生产中枯草芽孢杆菌的应用十分广泛。核糖核酸简称RNA，普遍存在于动植物体中，是生命的最基本物质之一，对生物的生长、遗传、变异等现象都起着重要的作用。RNA在医药、保健品、食品加工业等方面应用前景广泛，特别是在婴儿奶粉中作为关键功能营养因子，具有重要的应用。

目前，工业核糖核酸生产方法主要是从假丝酵母或酿酒酵母中提取。然而使用酵母生产核糖核酸核酸存在着一些问题：首先，假丝酵母不安全，它可能侵入皮肤、粘膜和内脏，引起炎症；另外，使用酿酒酵母，生产周期较长(一般需要1.5h～2h增殖一代)，同时细胞壁较厚，对破壁工艺要求较高。因此，为简化核糖核酸的生产工艺、提高生产效率，亟待开发新的食品安全微生物。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法，通过敲除可以提高菌株比生长速率的ATP结合蛋白基因oppD，以及胞内表达量较高但功能上非必需的鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD和鞭毛蛋白基因Hag，将核糖核酸含量的提高与枯草芽孢杆菌比生长速率相关联，并结合在特定筛选压力下的适应性进化方法，所述筛选压力为有限的碳氮源，以获得比生长速率提高的菌株，达到提高菌株RNA含量的目的。

本发明的第一个目的是提供一种核酸含量提高的枯草芽孢杆菌，敲除或沉默了ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白。

在一种实施方式中，所述ATP结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述鞭毛钩帽组件蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌168为出发菌株。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌168经过适应性进化。

在一种实施方式中，所述适应性进化是将枯草芽孢杆菌在特定配方的培养基中生长扩增，通过分批培养结合反复转接培养，使能够适应培养基环境的枯草芽孢杆菌逐渐富集成为优势菌株；其中，转接培养的次数不低于4次。

在一种实施方式中，所述适应性进化包括如下步骤：控制培养基中的葡萄糖处于低浓度，将枯草芽孢杆菌在多个容器进行平行培养，初始转接时间间隔控制为10～14小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03-0.05之间，根据每一批次终末的OD₆₀₀值选择生长最快(即OD₆₀₀值最大)的容器中的菌液转接至下一批次的容器中，逐渐缩短转接时长，以此获得将有益突变积累的进化菌株。