[发明专利]提高微生物转化生成乳糖酸的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20‑24h，然后添加促进培养基；继续发酵24‑36h，停止发酵，得到发酵液；步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10‑14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。本发明对废弃的湿菌体进行了二次利用，变废为宝，提高了乳糖酸的产率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及提高微生物转化生成乳糖酸的方法。

背景技术

乳糖酸是一种重要的药物中间体，广泛已应用于医药制备技术领域。目前，合成乳糖酸的方法主要包括化学法、酶法以及生物法。市场应用的乳糖酸主要由化学法制得，高耗能且需要昂贵的金属催化剂。化学法所用到的化学试剂是一些有毒的且昂贵的试剂；在反应过程中还会有副产物产生；利用金属催化合成乳糖酸，金属催化剂容易钝化；化学法对pH和温度的稳定的要求相对严格，还容易产生大量的副产物，造成环境污染。酶法合成乳糖酸相对于化学法具产物相对单一、产物易于分离和条件温和等优点，但是用于生物催化的酶需要生产和进一步纯化，而这些步骤成本较高，费时费力。

乳糖酸的生物合成法是一种可行的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成乳糖酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。中国专利技术“CN101988046A”公开了一种利用荧光假单胞菌生产乳糖酸的方法，该方法以乳糖为转化底物，添加氮源和无机盐作为发酵培养基，在最优选的条件下，转化率可达到90%，但是该发酵过程时间较长，持续时间为120h，此外还需要添加其他碳源，增加了成本，提高了后续分离纯化的难度。中国专利技术“CN102703542A”和“CN102250986A”分别通过超声波和高压物理场技术对荧光假单胞菌进行刺激，对乳糖酸的转化率有一定的提升作用。文献“乳糖酸产生菌的发酵培养基优化，食品工业科技2014年” 以乳糖酸生产菌土生拉乌尔菌为实验菌株，在单因素实验的基础上进行优化培养基和培养条件，使得发酵液中乳糖酸的浓度和转化率大幅提高。

目前，生物转化合成乳糖酸的研究大多处于实验室阶段，为了使得微生物催化乳糖生产乳糖酸应用于工业生产中，以满足其日益增长的市场的需求，针对某一特定的产乳糖酸的微生物，我们需要解决以下几个问题：首先，需要尽可能高地提高底物乳糖的浓度，从而提高乳糖酸的产量；其次，通过提高乳糖酸的转化率来提高生产效率；最后，控制培养时间和成本，并且减轻后续分离纯化产品的难度。据此，申请人之前的专利技术“一种利用生物法合成乳糖酸的工艺”对荧光假单胞菌发酵培养条件进行了优化，通过添加促进培养基，提高了乳糖酸的生产速率和转化率。

发明内容

本发明旨在上述专利技术的基础上，继续对发酵条件进行优化，以进一步提高乳糖酸的产量。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；

步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。

优选地，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1: 50-100的质量比混匀制得。