[发明专利]一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻腈水解酶的第77位、200位、224位或226位进行单位点突变或多位点突变获得。本发明通过对反应非专一性水稻腈水解酶分子改造，获得反应专一性显著提高的突变体，有利于定向生成目的产物。本发明构建的突变体Y77E/R224S/V226R催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酰胺，占产物含量的94.8％；构建的突变体K200R/R224W催化苯乙腈，反应主产物为苯乙酸，占产物含量的95.1％。反应专一性调控后的腈水解酶突变体在羧酸和酰胺类化合物的绿色合成中具有重要工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及腈水解酶反应专一性改变的突变体及应用。

背景技术

腈化合物是有机化工的重要原料，易转化为酰胺、羧酸、氧肟酸和酮等高附加值化学品，广泛应用于化工、农药和医药等领域。腈的酶法水解与水合具有过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等显著优势，成为羧酸、酰胺工业合成的重要方法。

一般认为，腈水解酶仅会专一地催化腈化合物水解生成羧酸。但文献表明，一些腈水解酶同时具有腈水合活性，催化腈化合物生成相应的酰胺，如Bradyrhizobiumjaponicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113)；Pseudomonas sp.UW4腈水解酶催化吲哚-3-乙腈水解，吲哚-3-乙酰胺的含量是吲哚-3-乙酸的4.3倍(Appl.Environ.Microbiol.,2014,80,4640)。

腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，即反应非专一性，使其在生物有机合成中既面临挑战，又蕴含应用潜力。一方面，腈水解酶的腈水合“副反应”存在会形成酰胺，不但降低腈水解反应产物羧酸的收率，也给后续分离工艺带来压力；另一方面，α-氨(羟)基酰胺的合成是制药工业中原子经济性和绿色化程度最低的反应类型之一。腈水合酶是催化合成酰胺的天然生物催化剂，但受氰离子(CN^-)强烈抑制。当其催化α-氨(羟)基腈时，由于α-氨(羟)基腈在水溶液中存在与酮(醛)及HCN的解离平衡，强配位体CN^-争夺腈水合酶活性中心的非血红素铁原子或非类可啉钴原子，形成低自旋的配合物，使酶不可逆失活。由于腈水解酶活性中心不需金属辅基，能够耐受高浓度氰离子，提高其酰胺合成能力可创制新型“腈水合酶”，开辟高效合成α-氨(羟)基酰胺的全新途径。因此，腈水解酶反应专一性调控对开发腈水解酶生物有机合成新功能具有重要意义。

国内外学者在腈水解酶反应专一性改造方面已经开展了一些研究。Kiziak等发现P.fluorescens EBC191腈水解酶165位丙氨酸被芳香族氨基酸取代后，降低了产物中扁桃酰胺的比例；而Alcaligenes faecalis腈水解酶164位色氨酸突变成丙氨酸后，扁桃酰胺的比例由0.7％上升至70％(Appl.Environ.Microbiol.,2009,75,5592)。Martínková等发现Neurospora crassa腈水解酶168位色氨酸突变成丙氨酸后，产物中酰胺的比例大幅升高(J.Mol.Catal.B Enzym.,2012,77,74-80.)。姜水琴等改造Synechocystis sp.PCC6803腈水解酶，获得了酰胺比例达到73％的突变体F193N，酰胺合成量是野生型的35倍，催化活力为野生型的50％(Catal.Sci.Technol.,2017,7,1122–1128)。以上研究为腈水解酶反应专一性调控提供了有益借鉴，但由于腈水合活力的强化或消除不彻底，突变体无法应用于工业生物催化过程。

发明内容

本发明的目的在于对水稻Oryza sativa腈水解酶(OsNIT)进行分子改造，获得腈水解酶反应专一性有效调控的突变体，从而满足工业生物催化应用的要求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：