[发明专利]一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法在审
| 申请号： | 202010013983.8 | 申请日： | 2020-01-07 |
| 公开（公告）号： | CN111088207A | 公开（公告）日： | 2020-05-01 |
| 发明（设计）人： | 陈可泉;李康;王昕;卢媛媛;王静;欧阳平凯 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/90;C12P7/50;C12R1/19 |
| 代理公司： | 南京先科专利代理事务所(普通合伙) 32285 | 代理人： | 叶帅东 |
| 地址： | 210000 江苏省南*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 提高 合成 戊二酸 产量 生物 催化 方法 | ||
1.一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在实验室已有质粒pACYC-gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC-gabTD（agtABCD），所述agtABCD 谷氨酸转运基因来源于
步骤2，减弱大肠杆菌上降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能；
步骤3，培养重组菌株E .coliBL-22AB和E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1，分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后，加入表面活性剂质量分数为0.5%TritonX-100，最后加入L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。
2.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤1中将agtABCD基因密码子优化后交由思普金生物科技有限公司合成于载体pACYC-gabTD的NcoI/EcoR I酶切位点之间，转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
3.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤2中在大肠杆菌BL21(DE3)中通过利用Crispr-Cas9编辑技术减弱降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能。
4.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤3中所述E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1的构建方法如下：将pACYC-gabTD（agtABCD）和pET28a-LGOX共同导入减弱α-酮戊二酸脱氢酶系的 BL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性和50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-YDT（agtABCD）-28LGOX1。
5.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，所述将重组菌株E .coli-YDT（ agtABCD ）-28LGOX1与
6.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，其特征在于，步骤3中所述L-赖氨酸和L-谷氨酸钠的添加的摩尔比为1：3。
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